一种提高蛋白表达效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高蛋白表达效率的方法，包括如下步骤：S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；S3在起始密码子ATG后4‑21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4‑21位核苷酸组成的茎环发夹结构；S4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site‑directed Mutagenesis Kit构建多个突变菌株。本发明专利技术具有较高的通用性和可行性，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种提高蛋白表达效率的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种提高蛋白表达效率的方法。
技术介绍
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。巴斯德毕赤酵母表达系统作为真核表达系统，有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性，具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达，营养要求低，培养基廉价，生长快，与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比，易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，有利于工业放大生产。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；/nS2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；/nS3在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；/nS4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit构建多个突变菌株；/nS41控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨...

【技术特征摘要】
1.一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；
S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；
S3在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；
S4以载体的快速定点诱变试剂盒StratageneQuikChangeSite-directedMutagenesisKit构建多个突变菌株；
S41控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；
S5在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；
S6控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵；
S7用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；
S8将重组蛋白的质粒转化进BL21(DE3)pLysS超级感受...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏泽旭，
申请(专利权)人：武汉恒意赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42