一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法。本发明专利技术提供了一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；2)将所述转化后黑麦草植株进行PCR/RE实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；本发明专利技术CRISPR/Cas核酸酶技术得到DMC1的敲除突变体，同源染色体之间不能正常配对组装形成二价体,这样就能够获得不育的植株的单价体，子代杂交就能形成单倍体，能够快速的缩短育种年限，在作物育种改良上起到显著的作用。

A method for obtaining non transgenic perennial ryegrass mutants

【技术实现步骤摘要】
一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法。
技术介绍
多年生黑麦草(LoliumperenneL.)是世界上最重要的牧草和草坪草，对黑麦草基因组的改造有利于黑麦草基因组的研究，对提高其生物、非生物胁迫和畜牧业的发展有重要意义。目前国内国际对黑麦草突变体的创制主要以EMS诱变为主，但这些方法费时费力，盲目性较大。当前的植物基因组工程(Genomeengineering)技术中，主要通过锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)来做基因改造，但是这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大。因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的黑麦草基因改造新技术。DMC1基因是减数分裂过程中特异表达的基因，仅在减数分裂前期I表达，是减数分裂过程中重组和联会复合体形成的关键基因。
技术实现思路
为了培育目标非转基因黑麦草突变体，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术提供了一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；2)将所述转化后黑麦草植株进行聚合酶链反应-限制性内切酶分析(PCR/RE)实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；有效突变为测序后缺失或者添加非3的倍数个碱基(即发生移码突变)；3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；所述黑麦草减数分裂蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和特异sgRNA；所述特异sgRNA的靶序列为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的核酸分子；(b2)与(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。上述方法中，所述特异sgRNA为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列1编码的RNA；(c2)与(c1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。上述方法中，所述通过CRISPR/Cas9系统抑制黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达为向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子，得到转化后黑麦草植株。上述方法中，所述向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子是向所述目的植物中导入表达Cas9蛋白的基因的质粒和表达特异sgRNA的质粒。所述表达Cas9蛋白的基因的质粒为pJIT163-2NLS-rCas9质粒；所述表达特异sgRNA的质粒为将含有sgRNA编码基因的质粒，实施例中为pTaU6-gRNA。上述方法中，所述PCR/RE实验的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成；所述引物1如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列2所示的核酸分子；(d2)与(d1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子；所述引物2如下(e1)或(e2)：(e1)序列表的序列3所示的核酸分子；(e2)与(e1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。上述方法中，所述选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株为用Cas9基因扩增引物进行PCR扩增，选取未得到目的片段的单株；所述Cas9基因扩增引物由引物3和引物4组成；所述引物3如下(f1)或(f2)：(f1)序列表的序列8所示的核酸分子；(f2)与(f1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子；所述引物4如下(g1)或(g2)：(g1)序列表的序列9所示的核酸分子；(g2)与(g1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。本专利技术还提供了一种sgRNA或表达其的质粒，所述sgRNA的靶序列为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的核酸分子；(b2)与(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子；本专利技术还提供了一种蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。上述特异sgRNA为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列1编码RNA；(c2)与(c1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。上述sgRNA或上述蛋白在制备黑麦草突变体中的应用也是本专利技术保护的范围。上述方法或上述蛋白在黑麦草育种中的应用也是本专利技术保护的范围。上述方法或上述蛋白在黑麦草育种中的应用也是本专利技术保护的范围；本专利技术还提供了一种培育黑麦草突变体的方法，为上述方法的步骤1)；本专利技术还提供了一种培育黑麦草突变体的方法，为上述方法的步骤1)和2)。CRISPR/Cas核酸酶技术是近年来发展起来的对基因组进行精准定点编辑的技术，具有操作简单、周期短、效率高等优点，利用该技术可以对基因组中的目的基因进行定向敲除、插入或定点突变，从而精确引入目标性状。相较于传统育种及转基因育种技术，CRISPR/Cas核酸酶技术能够明显缩短育种周期，仅需2-3年；针对性强，该方法在其他遗传物质不改变的前提下，只对目标基因进行编辑；更好地突破政策壁垒，该方法能够挑选出不引入任何外源基因的目标突变体，与自然变异无异。得到的DMC1的敲除突变体同源染色体之间不能正常配对组装形成二价体,这样就能够获得不育的植株的单价体，子代杂交就能形成单倍体，能够快速的缩短育种年限，在作物育种改良上起到显著的作用。附图说明图1为质粒pTaU6的物理图谱。图2为质粒pJIT163-2NLS-rCas9的物理图谱。图3为再生黑麦草的PCR/RE检测结果。图4为Cas9引物鉴定结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：/n1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；/n2)将所述转化后黑麦草植株进行聚合酶链反应-限制性内切酶分析实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；/n3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；/n所述黑麦草减数分裂蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：/n(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；/n(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；/n(a3)与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；/n所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和特异sgRNA；/n所述特异sgRNA的靶序列为如下(b1)或(b2)：/n(b1)序列表的序列1所示的核酸分子；/n(b2)与(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：
1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；
2)将所述转化后黑麦草植株进行聚合酶链反应-限制性内切酶分析实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；
3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；
所述黑麦草减数分裂蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(a3)与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和特异sgRNA；
所述特异sgRNA的靶序列为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的核酸分子；
(b2)与(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述特异sgRNA为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列1编码的RNA；
(c2)与(c1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述通过CRISPR/Cas9系统抑制黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达为向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子，得到转化后黑麦草植株。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子是向所述目的植物中导入表达Cas9蛋白的基因的质粒和表达特异sgRNA的质粒。


5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述PCR/RE实验的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成；
所述引物1如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列2所示的核酸分子；
(d2)与(d1)具有99％以上、95％以上、90...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉毅东，高崑，张康，张韫玮，
申请(专利权)人：天津吉诺沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12