一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法。本发明专利技术提供了一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；2)将所述转化后黑麦草植株进行PCR/RE实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；本发明专利技术CRISPR/Cas核酸酶技术得到DMC1的敲除突变体，同源染色体之间不能正常配对组装形成二价体,这样就能够获得不育的植株的单价体，子代杂交就能形成单倍体，能够快速的缩短育种年限，在作物育种改良上起到显著的作用。

A method for obtaining non transgenic perennial ryegrass mutants

【技术实现步骤摘要】
一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法。
技术介绍
多年生黑麦草(LoliumperenneL.)是世界上最重要的牧草和草坪草，对黑麦草基因组的改造有利于黑麦草基因组的研究，对提高其生物、非生物胁迫和畜牧业的发展有重要意义。目前国内国际对黑麦草突变体的创制主要以EMS诱变为主，但这些方法费时费力，盲目性较大。当前的植物基因组工程(Genomeengineering)技术中，主要通过锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)来做基因改造，但是这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大。因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的黑麦草基因改造新技术。DMC1基因是减数分裂过程中特异表达的基因，仅在减数分裂前期I表达，是减数分裂过程中重组和联会复合体形成的关键基因。
技术实现思路
为了培育目标非转基因黑麦草突变体，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术提供了一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：/n1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；/n2)将所述转化后黑麦草植株进行聚合酶链反应-限制性内切酶分析实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；/n3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；/n所述黑麦草减数分裂蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：/n(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；/n(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白...

【技术特征摘要】
1.一种培育目标非转基因黑麦草突变体的方法，包括如下步骤：
1)通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到转化后黑麦草植株；
2)将所述转化后黑麦草植株进行聚合酶链反应-限制性内切酶分析实验，选取酶切过程中未切开条带且测序为有效突变的单株为突变后黑麦草植株；
3)选取所述突变后黑麦草植株中不含有Cas9基因的单株，为目标非转基因黑麦草突变体；
所述黑麦草减数分裂蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列4所示的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(a3)与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和特异sgRNA；
所述特异sgRNA的靶序列为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的核酸分子；
(b2)与(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述特异sgRNA为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列1编码的RNA；
(c2)与(c1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述通过CRISPR/Cas9系统抑制黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达为向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子，得到转化后黑麦草植株。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述向目的植物中导入所述Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码DNA分子是向所述目的植物中导入表达Cas9蛋白的基因的质粒和表达特异sgRNA的质粒。


5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述PCR/RE实验的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成；
所述引物1如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列2所示的核酸分子；
(d2)与(d1)具有99％以上、95％以上、90...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉毅东，高崑，张康，张韫玮，
申请(专利权)人：天津吉诺沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12