一种获得串联酶功能缺失突变体的方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种获得串联酶功能缺失突变体的方法，EPSPS功能缺失的酵母突变体的方法及应用。所述重组酵母菌株通过生物基因工程的方法改变了酵母的Aro1基因，获得了只有EPSPS功能缺失的酵母突变体。

【技术实现步骤摘要】
一种获得串联酶功能缺失突变体的方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及到重组改造酵母，产生相应的功能的酵母突变体，及其在研发，药物，化工等领域的应用。
技术介绍
串联酶(tandemenzyme)是指由一条多肽链组成、具有两种或两种以上不同催化活性的蛋白质，也称为多功能酶(multifunctionalenzyme)。它通常催化同一代谢通路中的连续多个反应步骤。为了能在生物体内研究某个基因的功能或获得特异的突变体形式，一种常见的操作是创造相应基因的功能缺失突变体。例如在编码某一酶或蛋白的DNA序列中插入、缺失或改变一个或多个碱基序列，使得基因的DNA序列不能正确编码功能蛋白或产生没有功能的蛋白。而对于编码串联酶的基因，如果按上述方法去创造功能缺失突变体，往往会同时影响到所串联的两个或两个以上酶的活性，难以得到其中一个酶的功能丧失，而其他酶的活性正常的突变体，这样对于研究其中某一个酶的功能造成困难。比如在酵母中Aro1基因所编码的Aro1蛋白，就是一个具有5个酶功能的串联酶，它具有莽草酸途径合成芳香族氨基酸通路中的五种酶的催化活性，分别为：1.脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinatesynthase，缩写DHQS，国际分类编号EC4.2.3.4)；2.脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinatedehydratase，缩写DHQD，国际分类编号EC4.2.1.10)；3.莽草酸脱氢酶(Shikimatedehydrogenase，缩写SDH，国际分类编号EC1.1.1.25)；4.莽草酸激酶(Shikimatekinase，缩写SK，国际系统分类编号EC2.7.1.71)；5.5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(3-phosphoshikimate1-carboxyvinyltransferase，或5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，或EPSPsynthase，缩写EPSPS，国际分类编号EC2.5.1.19)。在酵母中，由于Aro1基因的结构特点，按照常规的方法，Aro1基因突变或者缺失后，会同时影响到上述多个其他酶的功能，无法获得只有EPSPS功能缺失的酵母突变体。酵母是一种单细胞真核生物，由于培养操作方便，常被作为模式真核生物用于研究当中，也常常用于医药，化工等等的研究和应用领域。本专利技术的目的在于提供获得串联酶突变体的方法，得到只有一种酶功能缺失的突变体的方法和突变体，及其在研发、医药和化工等等领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的研究人员在研发过程中，也发现此方法也可用于有类似结构的多基因串联成的开放的读码框(ORF)，利用本专利技术的方法在不影响其他串联基因功能的同时，获得特定基因功能缺失的生物突变体。本专利技术的目的在于提供获得特定基因功能缺失的生物突变体的方法在于，在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，该突变基因不能正确编码该基因片段，但不会影响其他功能基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与特定基因片段相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得该特定基因功能缺失的生物突变体。本专利技术的目的在于提供获得特定基因功能缺失的酵母突变体的方法在于，在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，该突变基因不能正确编码该基因片段，但不会影响其他功能基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与特定基因片段相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得该特定基因功能缺失的酵母突变体。本专利技术的目的在于提供获得EPSPS缺失的酵母突变体的方法在于，在Aro1基因上，先确定与EPSPS功能相关的基因片段的位置，是基因Aro1序列上从1198到2658的基因片段，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此增加或者减少的碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，突变基因不能正确编码与EPSPS功能相关的基因片段，但不影响其他基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与EPSPS功能相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得EPSPS功能缺失的酵母突变体。在本专利技术的一个实施例中，通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)的第1198-2658位的1461个碱基全部删除的方法获得了EPSPS功能缺失突变体。最终获得的突变体Aro1基因的序列变为如SEQIDNO:2所示。在本专利技术的一个实施例中，通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)的第1228-2595位的1368个碱基全部删除的方法获得了EPSPS功能缺失突变体。最终获得的突变体Aro1基因的序列变为如SEQIDNO:3所示。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1：pCAS载体图图2：YR11载体图图3：载体YCplac22载体图图4：YR45载体图图5：实施例子1突变体在SC-H培养基的生长比较图6:实施例子1突变体在SC-HFY培养基的生长比较图7：实施例子2突变体在SC-H培养基的生长比较图8：实施例子2突变体在SC-HFY培养基的生长比较具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但不限制本专利技术的专利范围。凡是利用本专利技术说明书或者附图内容所作的等效结构或者等效流程的变换，或者直接或间接运用在其它相关的
，均同理包括在本专利技术的专利保护范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本专利技术使用研究人员最常使用的酵母菌株BY4741作为例子，使用其他类型的酵母菌株也在本专利技术范围之内。YPAD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，硫酸腺嘌呤0.1g/L，D-葡萄糖20g/L。固体培养基中还需加入琼脂粉20g/L。SC-H培养基：YNB(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/L，D-葡萄糖20g/L，L-天冬氨酸0.05g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.05g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-脯氨酸0.05g/L，L-丝氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.05g/L，L-腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.获得特定基因功能缺失的生物突变体的方法包括以下几个步骤：/n1)在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，/n2)用生物技术的方法将生物体上的该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，/n3)根据第一步中确定的特定基因片段筛选生物突变体。/n

【技术特征摘要】
1.获得特定基因功能缺失的生物突变体的方法包括以下几个步骤：
1)在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，
2)用生物技术的方法将生物体上的该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，
3)根据第一步中确定的特定基因片段筛选生物突变体。


2.获得特定基因功能缺失的酵母突变体的方法包括以下几个步骤：
1)在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，
2)用生物技术的方法将酵母上的该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，
3)根据第一步中确定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴业春，祁幼林，靳海霞，
申请(专利权)人：科稷达隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11