表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明专利技术通过在酿酒酵母中异源表达小窝蛋白CAV1基因，获得能够内吞外源添加油脂的重组酿酒酵母。所述重组酿酒酵母能够通过转运油脂和脂肪酸来提高柚皮素的产量；此外，重组酿酒酵母菌中的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A含量也有所提高，通过添加棕榈酸分析神经酰胺产量，重组酿酒酵母菌有提高神经酰胺的作用。因而所述重组酿酒酵母在化妆品、医药、食品领域具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用
本专利技术涉及表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程及生物工程

技术介绍
微生物转化法由于其生物量积累快、转化时间短等特点，而逐渐被应用于工业化生产中制备各类化合物质。由于微生物细胞膜具有通透性，因此大分子物质不能随意进入细胞，而是依赖于细胞膜上的转运蛋白才能转运进入细胞。脂肪酸的吸收就需要依赖于转运蛋白，因此脂肪酸的转运过程限制了底物的可利用性和破坏了细胞膜的完整性，因此降低了细胞的生存能力和生物转化活性。外源添加的油脂更是无法透过细胞膜进入细胞被细胞所利用。因而造成了柚皮素、神经酰胺等需要利用油脂进行转化生产的化合物的低产。柚皮素(Naringenin)是一类存在于橘子皮等植物组织中的重要天然产物，是黄酮类物质的基本骨架，可经过不同的催化反应形成种类繁多并且具有高附加值的各种黄酮类化合物。柚皮素具有重要的生理功能，在食品、药品和化妆品领域等具有重要作用。目前柚皮素的生产方式是以从橘子皮中萃取为主，这导致其价格昂贵，且无法满足市场需求。基于生物合成学的发展，将柚皮素的合成途径在微生物中异源表达，实现了柚皮素的低成本的投入和高效合成的生产方式。但是，前体物质丙二酰辅酶A不足限制了柚皮素的合成。目前，针对微生物异源合成柚皮素的调控策略主要是莽草酸途径的代谢调控，竞争代谢途径的调控，细胞质中丙二酰辅酶A的合成途径的调控等，然而，这些调控策略对于柚皮素的合成仍然存在许多不足，并且丙二酰辅酶A是柚皮素合成的关键限速步骤，因此，强化丙二酰辅酶A的合成是强化柚皮素合成的关键步骤。乙酰辅酶A是脂肪酸β氧化过程的终产物，而乙酰辅酶A是丙二酰辅酶A的直接合成前体，因此脂肪酸的β氧化过程是提供丙二酰辅酶A的另一重要途径。但是，脂肪酸的吸收限制了脂肪酸的β氧化过程。神经酰胺(Ceramide)不仅具有维护皮肤的屏障功能而且还包括具有角质层的锁水性。虽然神经酰胺在人体皮肤中的确切作用尚不完全清楚。但是，神经酰胺已经广泛应用于化妆品和医药行业。相比与其它微生物，酵母生长迅速且无毒性，酿酒酵母更适合于生产神经酰胺。在酿酒酵母中，神经酰胺的合成以丝氨酸和棕榈酸为前体，长链脂肪酸棕榈酸需经过转运蛋白才能转运进入细胞，因此，前体物质的不足限制了神经酰胺的合成。小窝蛋白细胞生物学是生物医学研究中一个发展迅速的领域。小窝蛋白主要以其在内皮细胞间运输分子的能力而闻名，但现代细胞技术极大地扩展了我们对小窝蛋白的认识。它们在大多数细胞的表面形成一个独特的胞吞和胞吐的腔室，能够导入分子并将其传递到细胞内的特定位置，或者将分子输出到细胞外空间，并将各种信号活动分隔开。它们不仅是一个具有特殊膜形状的内吞装置，而且是构成一个具有多种细胞基本功能的完整的膜系统。但目前还未有小窝蛋白在转运油脂、脂肪酸中的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本申请旨在利用小窝蛋白对大分子的转运，以期提供一种更加高效和不破坏细胞完整性的的转运机制，促使其对合成生物学的发展具有潜在的指导价值和指导意义。本专利技术的第一个目的是提供一种重组质粒，所述质粒上含有小窝蛋白CAV1基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述小窝蛋白CAV1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述小窝蛋白CAV1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒为pRS系列载体。本专利技术的第二个目的是提供一种重组酿酒酵母，所述酿酒酵母含有所述重组质粒；所述酿酒酵母以酿酒酵母CER01或酿酒酵母ZLHB04-4为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，以酿酒酵母CER01为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为CER01/pRS423-CAV1。在本专利技术的一种实施方式中，以酿酒酵母ZLHB04-4为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为ZLHB04-4/pRS423-CAV1。本专利技术的第三个目的是提供一种促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法，所述方法为表达小窝蛋白CAV1或含有小窝蛋白CAV1基因；所述跨膜运输是将油脂类物质或脂肪酸运输进细胞内。在本专利技术的一种实施方式中，所述油脂包括但不限于棕榈油、菜籽油、橄榄油、花生油、椰子油、玉米油、大豆油。在本专利技术的一种实施方式中，所述脂肪酸包括但不限于油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、亚油酸、亚麻酸。本专利技术的第四个目的是提供一种促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法在提高柚皮素或神经酰胺产量方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1在含有棕榈酸的体系中发酵，合成神经酰胺。在本专利技术的一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1在含有油脂或脂肪酸的体系中发酵，合成柚皮素。本专利技术的第五个目的是提供一种提高细胞内的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平的方法，所述方法是将重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1在含有油脂或脂肪酸的体系中进行培养。本专利技术的第六个目的是提供所述重组质粒，或所述重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1和/或重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1，或促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法，或所述应用在食品、化妆品、医药领域提高以油脂或脂肪酸类物质为前体的代谢产物产量方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述以油脂或脂肪酸类物质为前体的代谢产物包括但不限于柚皮素、神经酰胺。本专利技术的第七个目的是提供所述提高细胞内的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平的方法在食品、医药领域制备柚皮素中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术在酿酒酵母中转入重组质粒pRS423-CAV1，得到了异源表达小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌，所述重组酿酒酵母菌具有内吞外源添加脂肪酸和油脂的作用，因此，基于重组酿酒酵母菌对外源添加油脂的内吞作用，为脂肪酸β氧化提供了所需的前体物质，从而强化了脂肪酸的β氧化过程，脂肪酸β氧化的终产物乙酰辅酶A进一步提高了胞内的丙二酰辅酶A的合成，从而打破了柚皮素合成的瓶颈限速步骤，进一步提高了柚皮素的产量，使得柚皮素的产量可达275mg/L。基于重组酵母菌对外源添加脂肪酸的内吞作用，为神经酰胺的合成提供更加充足的前体物质，因此促进了神经酰胺测合成，使得神经酰胺的产量可达30mg/L。附图说明图1为CAV1的穿梭质粒图谱。图2为CAV1重组酿酒酵母的菌落PCR验证的凝胶电泳图。图3为细胞内吞5.6-羧酸荧光素的激光共聚焦显微镜图，(A)：对照菌，(B)：CAV1的重组酿酒酵母菌。图4为细胞内吞被尼罗红染色的小油滴的荧光显微镜图，(A)：对照菌，(B)：CAV1的重组酿酒酵母菌。图5为细胞内和细胞外油脂的薄层层析分析，其中，M1：十九烷酸标品，M2：甘油三酯标品；通道1：YPD培养基下对照菌的细胞内油脂；通道2：YPD培养基下重组菌的细胞内油脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒含有小窝蛋白CAV1基因的DNA，所述小窝蛋白CAV1基因的核苷酸序列如含SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒含有小窝蛋白CAV1基因的DNA，所述小窝蛋白CAV1基因的核苷酸序列如含SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以pRS系列载体为表达载体。


3.一种重组酿酒酵母，其特征在于，含有权利要求1或2所述重组质粒。


4.根据权利要求3所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母以酿酒酵母CER01或酿酒酵母ZLHB04-4为宿主；
可选地，以酿酒酵母CER01为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为CER01/pRS423-CAV1；
可选地，以酿酒酵母ZLHB04-4为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为ZLHB04-4/pRS423-CAV1。


5.一种促进油脂类物质或脂肪酸类物质跨细胞膜运输的方法，其特征在于，表达小窝蛋白CAV1或含有小窝蛋白CAV1基因；所述跨膜运输是将油脂类物质或脂肪酸类物质运输进...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，张倩，曾伟主，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32