一种构建麦角硫因生产菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种圆红酵母工程菌及其构建方法，该圆红酵母工程菌能够表达外源的egt1酶，从而提高生产麦角硫因的能力，发酵后麦角硫因产量接近1.5g/L，且工程菌遗传性状稳定，具有工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种构建麦角硫因生产菌的方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种构建麦角硫因生产菌的方法，尤其涉及一种构建用于生产麦角硫因的圆红酵母菌的方法。
技术介绍
麦角硫因(L-ergothionine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，结构式如下：麦角硫因是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸。麦角硫因具有抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期或抗细胞衰老活性，改善神经细胞生成等多种生理功效。同时在多种疾病模型中包括阿兹海默、糖尿病等的并发症中，具有较好的保护细胞和抗击损伤的功效，市场应用前景广阔。目前，麦角硫因可以经化学合成、食用真菌提取和微生物发酵生产获得。有多种微生物被证实具有麦角硫因的合成能力，包括分枝杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多类微生物。有许多专利技术涉及利用微生物发酵生产麦角硫因，比如CN102978121B公开了食用菌白香蘑菌催化组氨酸底物可生成麦角硫因，底物转化率可达70％，未报道产物产率；CN103184246A公开了大型丝状真菌花脸香蘑摇瓶发酵10天，麦角硫因产量51mg/L；WO2017150304A1公开了青紫链霉菌Streptomyceslividans经7天发酵，麦角硫因产量900mg/L；WO2015180492A1公开了糙皮侧耳在75L发酵罐中经14天发酵，麦角硫因产量352mg/L；CN103734022公开了食用菌糙皮侧耳经7～15天发酵，麦角硫因产量最高产量达143.7mg/L；CN107250347公开了基因工程曲霉包括米曲霉、酱油曲霉和黑曲霉，经基因工程改造后，发酵产量可达438mg/L；大肠杆菌经基因工程改造，异源表达分枝杆菌的麦角硫因基因合成簇，麦角硫因产量640mg/L；CN106661585公开了大肠杆菌经基因工程改造，异源表达分枝杆菌的麦角硫因基因合成簇，工程菌发酵麦角硫因产量12mg/L；CN105296559A公开了糙皮侧耳食用菌经过多重发酵配方成分的调整，发酵至少6天，麦角硫因产量最高315.7mg/L；CN201910664772.8A公开了以枯草芽孢杆菌168为宿主表达外源基因，构建的基因工程菌麦角硫因产量达到568.4mg/L。文献(Takusagawa,S.,Y.Satoh,I.OhtsuandT.Dairi(2018)."ErgothioneineproductionwithAspergillusoryzae."Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry:1-4.)公开了米曲霉Aspergillusoryzae经基因工程改造，麦角硫因产量231mg/L。此外，目前微生物发酵麦角硫因的最高产量为文献(Tanaka,N.,Y.Kawano,Y.Satoh,T.DairiandI.Ohtsu(2019)."Gram-scalefermentativeproductionofergothioneinedrivenbyoverproductionofcysteineinEscherichiacoli."Scientificreports9(1):1895-1895.)报道，该研究利用基因工程手段，在大肠杆菌中异源表达分枝杆菌来源的麦角硫因的合成，研究获得工程菌，进行发酵罐培养，通过添加IPTG诱导打开合成开关，并持续性补加前体物质组氨酸，进行长达216h即9天的发酵，最终可获得1.3g/L麦角硫因产量。但作为一种条件致病菌以及转基因菌株，其产品应用前景令人担忧。寻找天然来源且具有食源安全属性的微生物，并开发合适的生产工艺，对解决麦角硫因高效生产尤为重要。文献(vanderHoek,S.A.,B.Darbani,K.E.Zugaj,B.K.Prabhala,M.B.Biron,M.Randelovic,J.B.Medina,D.B.KellandI.Borodina(2019)."Engineeringtheyeast&lt；em&gt；Saccharomycescerevisiae&lt；/em&gt；fortheproductionofL-(+)-ergothioneine."bioRxiv:667592.)公开了酿酒酵母Saccharomycescerevisiae经基因工程改造，对外源基因进行表达，可合成麦角硫因，产量可达到630mg/L。
技术实现思路
为了探索利用食源安全性的微生物通过发酵法生产麦角硫因的工业化途径，本专利技术利用基因工程技术来对天然圆红酵母(或称圆红冬孢酵母，Rhodotorulatoruloides)进行遗传改造，构建出了高产麦角硫因的菌株。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：一种EGT1基因表达盒，其选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3。其中SEQIDNO:1包含启动子pGPD、来源于粗糙链孢霉Neurosporacrassa的酶egt1的编码基因NcEGT1和酿酒酵母来源的CYC1t终止子，并在首尾分别添加XbaI和PmeI酶切位点，用于后续的质粒构建，本文中命名为Pgpd-NcEGT1-ScCYC1t；SEQIDNO:2包含启动子pGPD、来源于黑麦麦角菌Clavicepspurpurea的酶egt1的编码基因CpEGT1和酿酒酵母来源的CYC1t终止子，并在首尾分别添加XbaI和PmeI酶切位点，用于后续的质粒构建，本文中命名为Pgpd-CpEGT1-ScCYC1t；SEQIDNO:3包含启动子pGPD、来源于胶红酵母Rhodotorulamucilaginosa的酶egt1的编码基因RmEGT1和酿酒酵母来源的CYC1t终止子，并在首尾分别添加XbaI和PmeI酶切位点，用于后续的质粒构建，本文中命名为Pgpd-RmEGT1-ScCYC1t。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种EGT1基因表达质粒，其通过将上述的基因表达盒克隆在Puc57质粒上而获得。对应于基因表达盒名称，分别命名为Puc57-Pgpd-NcEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-CpEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-RmEGT1-ScCYC1t。根据本专利技术的第三个方面，提供了一种麦角硫因功能基因表达质粒(或称EGT1基因转化质粒)，其通过包括下述步骤的方法构建：1)使用限制性内切酶XbaI/PmeI对如权利要求2所述EGT1基因表达质粒Puc57-Pgpd-NcEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-CpEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-RmEGT1-ScCYC1t进行酶切，分别凝胶回收3.7kb、3.6kb、4.9kb片段，得到EGT1基因表达片段；2)使用限制性内切酶XbaI/PmeI对核苷酸序列为SEQIDNO:4的质粒pZPK-PGPD-Hyg-Tnos进行酶切，凝胶回收8.3kb片段，得到质粒骨架；3)将步骤1)中得到的EGT1基因表达片段与步骤2)中得到的质粒骨架相连接，得到麦角硫因功能基因表达质粒。与质粒Puc57-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EGT1基因表达盒，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
20200319 CN 20201019471081.一种EGT1基因表达盒，其选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3。


2.一种EGT1基因表达质粒，其通过将如权利要求1所述的基因表达盒克隆在pUC57质粒上而获得，分别命名为Puc57-Pgpd-NcEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-CpEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-RmEGT1-ScCYC1t。


3.一种麦角硫因功能基因表达质粒，其通过包括下述步骤的方法构建：
1)使用限制性内切酶XbaI/PmeI对如权利要求2所述EGT1基因表达质粒Puc57-Pgpd-NcEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-CpEGT1-ScCYC1t、Puc57-Pgpd-RmEGT1-ScCYC1t进行酶切，分别凝胶回收3.7kb、3.6kb、4.9kb片段，得到EGT1基因表达片段；
2)使用限制性内切酶XbaI/PmeI对核苷酸序列为SEQIDNO:4的质粒pZPK-PGPD-Hyg-Tnos进行酶切，凝胶回收8.3kb片段，得到质粒骨架；
3)将步骤1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，王金刚，任亮，俞想，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33