鸟氨酸环化脱氨酶催化合成L-哌啶酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用鸟氨酸环化脱氨酶制备L

【技术实现步骤摘要】
鸟氨酸环化脱氨酶催化合成L
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哌啶酸的方法


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体地说，涉及一种利用鸟氨酸环化脱氨酶催化制备L
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哌啶酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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哌啶酸(CAS3105
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95
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1，L
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pipecolic acid，简称PA)是亚氨基酸的一种，在大多数植物中以游离态存在，特别是在豆科植物中发现有较高的浓度，作为一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，可以广泛用于许多手性药物的合成，哌啶酸及其衍生物是一类应用广泛的医药中间体。例如，新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(Sandramycin)等均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。
[0003]由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，围绕其制备，人们已开发出许多合成的新方法和新技术。目前的制备方法主要分为生物化学催化、化学不对称合成和光催化合成。由于L
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哌啶酸是手性分子，不对称手性合成较困难，因此利用选择性高的酶催化方法制备高光学纯度的L
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哌啶酸一直是研究热点。
[0004][0005]专利文献CN1529756A报道了根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens C58)来源的鸟氨酸环化脱氨酶(ornithine cyclodeaminase，OCD)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis ATCC25486)来源的亚氨基肽酶pipA、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)来源的赖氨酸环化脱氨酶(rapL)等酶将L
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赖氨酸直接脱氨环化转化为L
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哌啶酸。专利文献CN109402099A进一步报道了始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis ATCC25486)来源的赖氨酸环化脱氨酶(Lysine cyclodeaminase，LCD)及其突变体可将L
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赖氨酸转化为L
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哌啶酸，证明酶催化方法将L
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赖氨酸转化为L
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哌啶酸这一路径是个有应用前途的绿色工艺。
[0006]然而，经实验证实，采用上述专利文献中报道的酶进行L
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赖氨酸转化时的实际催化反应效率却相差甚远，明显偏低，远达不到工业化应用的酶活力/催化效率要求。

技术实现思路

[0007]为了探索酶催化L
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赖氨酸转化法制备L
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哌啶酸的工业化可行性，专利技术人对于众多微生物来源的鸟氨酸环化脱氨酶(OCD)、赖氨酸环化脱氨酶(LCD)、亚氨基肽酶pipA等酶进行了广泛筛选，终于筛选到几种酶活力比上述现有技术酶有明显提高(高出至少一倍)的酶
品种，包括生黑孢链霉菌(Streptomyces melanosporofaciens)来源的鸟氨酸环化脱氨酶(NCBI登录号WP_093467660.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:1)；以此酶为基础，我们还对其进行了突变，以便提高其酶活力。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0008]一种酶催化制备L
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哌啶酸的方法，包括如下步骤：以L
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赖氨酸为底物，使用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1、或者其(G69V,G145L)突变体SEQ ID NO:3或(G69N,V142H)突变体SEQ ID NO:5催化环化脱氨反应，得到L
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哌啶酸。
[0009]其中，鸟氨酸环化脱氨酶突变体SEQ ID NO:3其为野生型鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1氨基酸序列G69V、G145L的突变体：
[0010]METTVLTRQHVAKIVQGKGLDLFMDRMIDRLDEAFRAESRWGITPARDGFVRGPQNTAVLEWMPHHQPVDSITIKTVAYTPTNPFTHQLPTIIGTMARYDDVTGRLLAVGDGILPTAVRTGAASAIASRLLAHPDSRVLGLVGALAQAVTQAHALSRVFRLDRILVHDIEPAHAESFAERVEFLGIDVEVASVAEIEAASDIICTVTSVGVGDGPVLHGERLRPHVHINAIGADLIGKYEVPLSVLKSAFVTPDHQGQALREGECQQLDQSELGPELPALCADPALAEGRREQPTVFDSTGFALEDHVAFDVLLELAEEAGIGDRVQLEHLPEDALNPYSFQ(SEQ ID NO:3)；
[0011]鸟氨酸环化脱氨酶突变体SEQ ID NO:5为SEQ ID NO:1氨基酸序列G69N、V142H的突变体：
[0012]METTVLTRQHVAKIVQGKGLDLFMDRMIDRLDEAFRAESRWGITPARDGFVRGPQNTAVLEWMPHHQPNDSITIKTVAYTPTNPFTHQLPTIIGTMARYDDVTGRLLAVGDGILPTAVRTGAASAIASRLLAHPDSRVLGLHGAGAQAVTQAHALSRVFRLDRILVHDIEPAHAESFAERVEFLGIDVEVASVAEIEAASDIICTVTSVGVGDGPVLHGERLRPHVHINAIGADLIGKYEVPLSVLKSAFVTPDHQGQALREGECQQLDQSELGPELPALCADPALAEGRREQPTVFDSTGFALEDHVAFDVLLELAEEAGIGDRVQLEHLPEDALNPYSFQ(SEQ ID NO:5)。
[0013]更优选地，上述方法采用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:3作为生物催化剂来催化L
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哌啶酸的反应。
[0014]在一种可选的实施方式中，上述鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5可以呈其表达微生物菌体形式。
[0015]该反应体系优选为缓冲溶液，可以为磷酸缓冲溶液，例如为pH6.5
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7.5、优选pH6.8
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7.2、更优选pH7.0左右的缓冲溶液。
[0016]上述反应温度可以为25
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45℃。
[0017]本专利技术的第二个方面提供了一种鸟氨酸环化脱氨酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。
[0018]本专利技术的第三个方面提供了编码上述鸟氨酸环化脱氨酶的基因。
[0019]优选地，编码鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶催化制备L
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哌啶酸的方法，包括如下步骤：以L
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赖氨酸为底物，使用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1、或者其(G69V,G145L)突变体SEQ ID NO:3或(G69N,V142H)突变体SEQ ID NO:5催化环化脱氨反应，得到L
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哌啶酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:3作为催化剂。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5呈其表达微生物菌体形式。4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，杨海锋，黎肖平，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：