苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用；属于生物化工技术领域；所述腈水合酶催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物；所述腈水合酶来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。本发明专利技术以氰基吡嗪类化合物为底物，利用离体的腈水合酶或表达腈水合酶的细胞作为催化剂，进行水合反应，能够获得酰胺吡嗪类化合物。本发明专利技术的应用原料转化率高，没有副反应，产物易于分离提纯且纯度较高；与传统化学催化工艺相比，本发明专利技术工艺绿色环保且操作简便，产率超过99％。产率超过99％。产率超过99％。

【技术实现步骤摘要】
苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用
[0001]本申请是申请日为2020年06月23日、申请号为202010580723.9、专利技术名称为《腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用》的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物化工
，尤其涉及苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用。

技术介绍

[0003]酰胺吡嗪(或称吡嗪酰胺)是一种重要的抗结核药物，对结核病有很好的疗效。近年来发现酰胺吡嗪对顽固菌有较好的杀菌作用，故在临床广泛应用；而且酰胺吡嗪可作为中间体，用于制备各种抗菌、抗病毒药物。例如，酰胺吡嗪的衍生物：6
‑
氟
‑3‑
羟基
‑2‑
酰胺吡嗪，也称法匹拉韦(英语：Favipiravir，也称为Avigan或favilavir)，是一种抗病毒药物，由日本富山大学医学部白木公康教授与富士胶片旗下富山化学工业(今富士胶片富山化学)共同研发，该药能够对抗多种RNA病毒。法匹拉韦具有降低流感病毒、西尼罗河病毒、黄热病、口蹄疫病毒以及其他多种病毒活性的作用；其还被证明能够抑制活性如肠道病毒和裂谷热；该药还表现出对抗狂犬病的功效，并已被实验性的用于治疗感染狂犬病毒的患者。2020年2月，法匹拉韦在中国被用于2019冠状病毒病(COVID
‑
19)的试验性治疗，3月17日，在武汉和深圳进行的试验中发现该药能有效治疗感染者，早期报告表明该药可有效治疗该疾病。
[0004]对于法匹拉韦的制备方法，主要有化学合成法和生物催化法。化学合成法方面，专利文献WO0010569公开了一种由6
‑
溴
‑3‑
氨基
‑2‑
吡嗪羧酸甲酯经多步反应来制备；专利文献WO2010087117A1公开了一种由3
‑
羟基
‑2‑
吡嗪酰胺经溴代后多步反应制备。专利文献CN102603658A以6
‑
溴
‑3‑
氨基
‑2‑
吡嗪酰胺作为原料再经过保护氨基、卤素置换、脱保护、叠氮化四步反应制备。但是，这些已知的化学合成制备方法存在以下缺点：合成较为复杂，工艺繁琐，转化率和总收率都较低。
[0005]生物催化应用在有机合成工艺上拥有巨大的潜力，有着化学方法无法替代的优越性，如：反应条件温和、环境友好、成本低、无副反应等。在制备酰胺类化合物时，利用腈水合酶(NHase，E.C.4.2.1.84)催化腈类化合物水合反应生成酰胺，是一种较佳的选择。其中，一些产腈水合酶的微生物已用于丙烯酰胺、烟酰胺、2
‑
氨基
‑
2,3
‑
二甲基丁酰胺等的生产中：如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas Testosteroni 5
‑
MGAM
‑
4D、专利号为ZL88106735的专利文献公开了一种玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodococcus J
‑
1、专利号为ZL103834600的专利文献公开了一株恶臭假单胞菌Pseudomonasputida，这些野生菌株都用于丙烯酰胺的生产中。但应用于吡嗪酰胺制备的腈水合酶目前报导较少。世界专利文献WO2006049618A1报导了以E.coli SW132为表达宿主、克隆表达来源于Comamonas testosteroni 5
‑
MGAM
‑
4D的腈水合酶生产2
‑
酰胺吡嗪，重
组E.coli SW132细胞在23℃的磷酸盐缓冲体系(pH7.0)中催化转化浓度为0.5
·
M的2
‑
氰基吡嗪15min，转化率为100％。中国专利CN101481713A公开了一种以2
‑
氰基吡嗪为底物、以表达腈水合酶的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZJB09104为生物催化剂，生产2
‑
酰胺吡嗪。
[0006]虽然目前各种数据库中的腈水合酶的基因资源较为丰富，但能够催化底物氰基吡嗪制备酰胺吡嗪的腈水合酶较少。更为重要的是，目前还没有文献报导能够催化氰基吡嗪类化合物直接制备酰胺吡嗪类化合物(例如法匹拉韦)的腈水合酶。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用；所述腈水合酶来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。
[0010]优选的，来源于所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；来源于所述聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4；来源于所述苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]优选的，所述的氰基吡嗪类化合物的化学式如式I所示；所述酰胺吡嗪类化合物的化学式如式II所示；
[0012][0013]式I和式II中：
[0014]R1选自H，CH3，F，Cl，Br，或者I；
[0015]R2选自H，NH2或者OH。
[0016]优选的，所述的氰基吡嗪类化合物包括2
‑
氰基吡嗪，3
‑
甲基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
甲基
‑
2
‑
氰基吡嗪，6
‑
甲基
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
溴
‑3‑
氨基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
氟
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
氯
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
溴
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪或6
‑
碘
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.苜蓿中华根瘤菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用；所述腈水合酶催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物；所述腈水合酶来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，来源于所述苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氰基吡嗪类化合物的化学式如式I所示；所述酰胺吡嗪类化合物的化学式如式II所示；式I和式II中：R1选自H，CH3，F，Cl，Br，或者I；R2选自H，NH2或者OH。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的氰基吡嗪类化合物包括2
‑
氰基吡嗪，3
‑
甲基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
甲基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
甲基
‑3‑
羟基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
溴
‑3‑
氨基
‑2‑
氰基吡嗪，6
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：姚红，倪泉明，王伟文，黄晓飞，陈文斌，
申请(专利权)人：浙江恒康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：