构建产L-丝氨酸大肠杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建产L

【技术实现步骤摘要】
构建产L
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丝氨酸大肠杆菌的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种构建产L
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丝氨酸大肠杆菌的方法以及该菌株的应用。

技术介绍

[0002]L
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丝氨酸，即β
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羟基丙氨酸，在生物体细胞内处于多种氨基酸和生物活性蛋白代谢中枢，对机体的生长至关重要，L
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丝氨酸还在化工、农药、化妆品等行业有着关键的应用。
[0003]目前，L
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丝氨酸生产方法通常有蛋白质水解提取法、化学合成法、生物酶法、发酵法等。蛋白提取法原料成本高，分离纯化工艺复杂，环境污染严重；化学合成法合成后为混旋丝氨酸，还需要进行拆分才能获得L
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丝氨酸；生物酶法一种是以混旋丝氨酸为前体进行酶法转化获得一种手性氨基酸，另外一种是以甘氨酸和甲醇为前体进行合成，这两种方法生成成本都比较高；发酵法制备L
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丝氨酸是一种经济可行的方法，但是目前发酵菌株产量不高，并且大部分需要添加前体甘氨酸，使得发酵成本较高。开发可利用廉价原料且能高产L
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丝氨酸菌株仍是研究开发的重点。
[0004]2016年，丹麦工业大学Mundhada等以E.coli MG1655为出发菌株，敲除L
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丝氨酸降解路径相关基因tdcG、sdaA、sdaB和glyA，过表达serA
fbr
、serB、serC，在补料发酵中产L
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ser 11.7g/L，转化率为0.43g/g葡萄糖；随后再通过实验室进化最终可产37g/L产物，转化率为0.24g/g。2019年，丹麦工业大学Rennig等采用基于可调控的抗生素标记的合成进化方法，对serA、serB、serC转录起始区进行定向进化，随后通过实验和计算机辅助设计，获得可产L
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丝氨酸50g/L的菌株，糖酸转化率达到0.36g/g。2020年，上海高研院发表文献报道以大肠杆菌为出发菌株，敲除glyA和SdaA后，质粒过表达pgk、serA
fbr
、serB和serC，同时敲除L
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丝氨酸内运基因sdaC、sstT、tdcC后，获得菌株在5L发酵罐发酵32h，终浓度达到34.8g/L，转化率达到32％。上述菌株敲除了glyA基因，在发酵过程中同样要添加甘氨酸，发酵成本较高。

技术实现思路

[0005]为了开辟一种无需在培养基中添加甘氨酸即可通过大肠杆菌发酵实现以葡萄糖为原料从头合成L
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丝氨酸的新途径，专利技术人通过代谢工程来改造工业上最常用的基因工程菌宿主大肠杆菌，最终获得了一株产L
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丝氨酸的工程菌。因此，本专利技术包括如下技术方案。
[0006]一种构建产L
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丝氨酸大肠杆菌的方法，其包括以下步骤：
[0007]A.在大肠杆菌基因组中整合T7RNA聚合酶基因，以便促进T7RNA聚合酶的表达，从而提高3
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磷酸甘油酸脱氢酶SerA(H344A,N346A,N364A)突变体即SerAmut、磷酸丝氨酸磷酸酶SerB和磷酸丝氨酸转氨酶SerC的表达水平，得到菌株A；
[0008]B.敲减菌株A基因组中L
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丝氨酸降解途径相关基因包括丝氨酸羟甲基转移酶GlyA、高丝氨酸脱氢酶thrA、丝氨酸脱水酶sdaA、丝氨酸脱水酶同工酶sdaB和L
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丝氨酸转运蛋白sdaC、丝氨酸脱水酶同工酶tdcG和苏氨酸脱氢酶tdcB中的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选全部，得到菌株B；
[0009]C.在菌株B基因组中分别整合一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的抗反馈抑制丝氨酸脱水酶突变体SerAmut、磷酸丝氨酸转氨酶SerB和磷酸丝氨酸转氨酶SerC基因，筛选阳性克隆，得到菌株C；
[0010]D.从菌株C中筛选出生产L
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丝氨酸的菌株。
[0011]上述SerA、SerB和SerC基因都来源于大肠杆菌，其中SerA发生(H344A,N346A,N364A)突变使SerA抗反馈抑制。
[0012]步骤B中，术语“敲减”包括但不限于敲除、失活、下调表达。其中GlyA基因的失活/下调采用突变方式，例如glyA起始密码子ATG发生GTG突变，表示为glyA
gtg
；thrA基因的失活/下调采用突变方式，例如发生S357R突变，表示为thrA
mut
；tdcG基因、sdaA基因和sdaB基因和sdaC可以敲除。
[0013]相对应地，步骤B可以为：敲减菌株A基因组中L
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丝氨酸降解途径相关基因丝氨酸羟甲基转移酶GlyA、丝氨酸脱水酶sdaA、丝氨酸脱水酶同工酶sdaB、高丝氨酸脱氢酶thrA、苏氨酸脱氢酶tdcB基因，得到菌株B。
[0014]上述步骤A、步骤B和步骤C可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术进行基因工程操作。
[0015]上述基因编辑技术可以采用CRISPR/Cas系统(包括CRISPR/Cpf1系统CRISPR
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Cas9系统)、CRISPR
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Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
[0016]上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertion of transposable elements by guide RNA
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assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR
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associated transposase，CRISPR相关转座酶)。
[0017]在一种实施方式中，上述CRISPR/Cas系统可以是pCasSac质粒(addgene 73227)与辅助质粒pTargetF(addgene 62226)的双质粒组合。
[0018]优选地，上述步骤A、步骤B和步骤C中基因组敲减/整合供体片段是以核苷酸序列为SEQ ID NO:1的质粒pET28a
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serAmutCB为PCR模板制备的。
[0019]上述大肠杆菌可以是大肠杆菌MG1655。
[0020]在一种可选的实施方式中，上述基因编辑技术可以包括如下步骤：
[0021]1.以质粒pTargetF(addgene 62226)为模板，构建不同基因组编辑位点的pTargetF相关质粒pTargetF
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lacZ、pTargetF
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SdaBC、pTargetF
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tdcG、pTargetF
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thrAmut、pTargetF
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glyAmut、pTargetF...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建产L
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丝氨酸大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.在大肠杆菌基因组中整合T7RNA聚合酶基因，得到菌株A；B.敲减菌株A基因组中L
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丝氨酸降解途径相关基因包括丝氨酸羟甲基转移酶GlyA、高丝氨酸脱氢酶thrA、丝氨酸脱水酶sdaA、丝氨酸脱水酶同工酶sdaB和L
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丝氨酸转运蛋白sdaC、丝氨酸脱水酶同工酶tdcG和苏氨酸脱氢酶tdcB中的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上，得到菌株B；C.在菌株B基因组中分别整合一个以上拷贝的抗反馈抑制丝氨酸脱水酶SerA(H344A,N346A,N364A)突变体即SerAmut、磷酸丝氨酸转氨酶SerB和磷酸丝氨酸转氨酶SerC基因，筛选阳性克隆，得到菌株C；D.从菌株C中筛选出生产L
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丝氨酸的菌株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A、步骤B和步骤C采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术进行基因工程操作。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术采用CRISPR/Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，刘映淼，丁鹏，高书良，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：