一种构建丙酸生产菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建丙酸生产菌的方法，包括以下步骤：中断谷氨酸棒杆菌基因组中ldh基因，整合入大肠杆菌来源的scpA、scpB和scpC的表达基因，筛选出厌氧条件下生产丙酸、但不生产乳酸的工程菌。该工程菌发酵产生的丙酸能够用于制备食品级的丙酸钙。够用于制备食品级的丙酸钙。

【技术实现步骤摘要】
一种构建丙酸生产菌的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种产丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法、以及食品级丙酸钙的制备方法。

技术介绍

[0002]丙酸钙广泛应用于食品、酿造、饲料、中药等行业，如面包、食醋、酱油、酱油食品蛋糕等。像其他脂肪酸一样，丙酸钙可以通过新陈代谢被人和动物吸收，并为人和动物提供必要的钙。丙酸钙被世卫组织和粮农组织批准用于安全食品和饲料使用酸基防腐剂，在酸性条件下，产生游离酸，具有抗菌作用，其防腐性能优越，是一种理想的食品防腐剂。Global Industry Analysts,Inc.于2021年发布的调研报告指出，丙酸钙2020年估算为2亿8,130万美元的全球市场，在2020年～2027年期间预计将以4％的年复合成长率增长，2027年之前达到3.7亿美元。
[0003]丙酸钙主要制备方法是由丙酸和氢氧化钙直接反应制备丙酸钙，此方法耗能高，污染大，由于化工产品丙酸不是生物基来源，一定程度上影响其在高端产品中的应用。此外还有发酵法制备丙酸，然后发酵液浓缩后加入氢氧化钙进行反应制备丙酸钙，目前丙酸发酵菌株主要有产酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌等，产物浓度最高可达90g/L，但是发酵周期要300小时(Gonzalez
‑
Garcia R.,et al.,Microbial Propionic Acid Production[J].Fermentation,2017,3(2):21.)。Jing L.等(Jing L.,et al.,Construction of a novel anaerobic pathway in Escherichia coli for propionate production[J].Bmc Biotechnology,2017,17:1.)报道了一种产丙酸大肠杆菌，厌氧发酵72h可产丙酸4.95g/L。虽然大肠杆菌增殖速度很快，考虑到丙酸钙越来越多地用于食品、药品制造，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过大肠杆菌发酵获得的丙酸难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

技术实现思路

[0004]为了克服上述产酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌增值速度慢且发酵周期过长、大肠肝菌造成发酵产品销售障碍和接受度低的缺陷，提高丙酸/丙酸钙被食品和药品销售商和消费者的接受度，专利技术人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等作为菌种通过发酵来生产丙酸的可行性，终于在谷氨酸棒杆菌中取得了成功。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0005]一种构建丙酸生产菌的方法，其包括以下步骤：
[0006]A.中断谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh，NCBI登录号NP_602100.1)基因，得到菌株A；
[0007]B.构建用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA，NCBI登录号：NP_417392.1)基因表达元件、大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB，NCBI登录号：NP_311816.2)基因表达元件、大肠杆菌来源的丙酰辅酶A：琥珀酰辅
酶A转移酶(scpC，NCBI登录号：NP_417396.4)基因表达元件，并将这三个基因表达元件分别或者共同克隆入用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的质粒载体中，得到基因表达质粒；
[0008]C.将步骤B中得到的基因表达质粒转入步骤A中得到的菌株A中，筛选基因组中整合了所述scpA、scpB和scpC编码基因的阳性克隆即菌株C；
[0009]D.从菌株C中筛选出厌氧条件下生产丙酸的工程菌。
[0010]优选地，上述每个基因表达元件包括启动子Psod、编码基因序列、终止子rrnBT1T2。
[0011]在一种实施方式中，甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA)编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，但不限于此；甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB)编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，但不限于此；丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC)编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，但不限于此。
[0012]上述步骤B中所述质粒载体优选是pEKEX2。
[0013]在一种优选的实施方式中，步骤B中三个基因表达元件克隆入同一个质粒载体pEKEX2中，得到pEKEX2
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ScpABC质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
[0014]上述方法中，宿主谷氨酸棒杆菌优选是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
[0015]优选地，步骤D中筛选出的工程菌发酵时不生产乳酸，从而为丙酸的提取分离提供了极大方便，有利于降低生产成本。
[0016]上述步骤A可以是敲除谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh)基因，包括下述步骤：
[0017]A1.以ATCC13032基因组为模板，使用引物对Ldh
‑
up
‑
F和Ldh
‑
up
‑
R进行PCR扩增，得到约0.8kb的ldh基因上游同源臂片段ldh
‑
up；
[0018]A2.以ATCC13032基因组为模板，引物对Ldh
‑
dn
‑
F和Ldh
‑
dn
‑
R进行PCR扩增，得到约0.8kb的ldh基因下游同源臂片段ldh
‑
dn；
[0019]A3.以ldh
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up和ldh
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dn片段为模板，使用引物对Ldh
‑
up
‑
F/Ldh
‑
dn
‑
R进行OE
‑
PCR扩增ldh
‑
up
‑
dn片段；
[0020]A4.将ldh
‑
up
‑
dn片段与PstI/HindIII线性化pK18mobsacB质粒进行同源拼接，转化DH5α感受态细胞，转化子抽质粒测序鉴定，获得质粒pK18mobsacB
‑
ldh，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5；
[0021]A5.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；
[0022]A6.将质粒pK18mobsacB
‑
ldh转化入ATCC13032感受态细胞；
[0023]A7.进行SacB蔗糖反筛，使用引物对ldh
‑
KO
‑
F和ldh
‑
KO
‑
R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(Δldh)即菌株A。
[0024]本专利技术的第二个方面在于提供一种丙酸生产菌，其通过上述的方法构建得到。
[0025]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建丙酸生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.中断谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh，NCBI登录号：NP_602100.1)基因，得到菌株A；B.构建用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA，NCBI登录号：NP_417392.1)基因表达元件、大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB，NCBI登录号：NP_311816.2)基因表达元件、大肠杆菌来源的丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC，NCBI登录号：NP_417396.4)基因表达元件，并将这三个基因表达元件分别或者共同克隆入用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的质粒载体中，得到基因表达质粒；C.将步骤B中得到的基因表达质粒转入步骤A中得到的菌株A中，筛选基因组中整合了所述scpA、scpB和scpC编码基因的阳性克隆即菌株C；D.从菌株C中筛选出厌氧条件下生产丙酸的工程菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中每个基因表达元件包括启动子Psod、编码基因序列、终止子rrnBT1T2。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，甲基丙二酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，丁鹏，高书良，刘映淼，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：