构建依克多因生产菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建依克多因生产菌的方法，构建的基因工程菌CGMCC No.22733能够以葡萄糖为碳源，通过发酵直接生产依克多因，5L发酵罐发酵48小时，可产依克多因42.7g/L，具有开发和应用潜力。开发和应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
构建依克多因生产菌的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种构建依克多因生产菌的方法、构建得到的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]依克多因(Ectoin)，化学名为2
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甲基
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1,4,5,6,
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四氢嘧啶
‑4‑
羧酸，又名四氢甲基嘧啶羧酸，易溶于水、甘油、丙二醇、乙醇等。分子为C6H
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O2N2，结构式如下所示：
[0003][0004]1985年，Galinski教授在埃及沙漠发现嗜盐菌在高温、干燥、强UV照射、高盐度环境下，会在细胞外层生成一种天然保护成分
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依克多因，能使嗜盐菌免受伤害，从而进行自我修护；研究表明，依克多因同样对皮肤有很好的修复保护作用。他是欧莱雅、雅诗兰黛等高档化妆品采用的生物工程制剂之一，同时还可用于医疗保健，比如应激性皮炎，肺炎，过敏性鼻炎和老年痴呆症等。有文献报道，依克多因的市场售价达1000美元/公斤(Genes 2018,9(4),177.)，未来具有较大市场潜力。
[0005]目前，Ectoin主要是以嗜盐菌发酵来制备，高盐发酵不仅影响发酵容器的寿命，对后续发酵废液处理也是很大的挑战。1999年，Ono等报道了高嗜盐菌(Halomonas elongata)中依克多因的合成途径并鉴定了相关酶(J Bacteriol.1999,181:91
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9.)，早期发酵生产主要是使用这个菌株，同时还生成氢化依克多因。随着基因工程技术的发展，研究人员尝试用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等常规发酵宿主，通过基因工程改造使其产Ectoin(参见Microb Cell Fact.2021,20:76.)，大肠杆菌基因工程菌株可产25g/L依克多因，转化率达到0.11g/g葡萄糖(Metabolic Engineering.2016,36:10
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18.)；Becker等以谷氨酸棒杆菌为宿主菌构建了高产赖氨酸的基因工程菌株，发酵浓度可达120g/L(Metabolic Engineering.2011,13:159
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168.)；随后，他们又在谷氨酸棒杆菌LYS
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1中表达了来源于Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，并敲除lysE基因以便防止赖氨酸的外排，在低盐浓度下可产依克多因4.5g/L(Microbial Cell Factories.2013,12:110.)；Giesselmann等以Corynebacterium glutamicum lysC
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作为出发菌株，通过不同的启动子组合优化ectA、ectB和ectC的表达，平衡了相关代谢流，最终获得菌株发酵56h可产65g/L依克多因(Biotechnol.J.2019,14,1800417)，转化率达到0.19g/g葡萄糖。

技术实现思路

[0006]专利技术人对已报道的谷氨酸棒杆菌中依克多因的生物合成路线进行了研究，开发出一种新的代谢路径，以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过弱化hom基因，敲除pck基因，并用sod启动子增强lysC和tkt
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tal
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zwf的表达，然后在ddh基因位点和噬菌体转座酶IS30(IS30
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like element，ISCg2 family transposase)基因位点整合ectABC基因，构建出依克多因生产菌。因此，本专利技术包括如下技术方案。
[0007]一种构建依克多因生产菌的方法，其包括以下步骤：
[0008]A.以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，敲减或弱化基因组中编码高丝氨酸激酶的hom基因，得到下调高丝氨酸激酶表达的菌株A；其中，hom基因的敲减包括、但不限于敲除hom基因、下调hom基因的表达、或者弱化hom的高丝氨酸激酶的酶活力，例如可以使hom基因发生突变从而弱化高丝氨酸激酶的功能；
[0009]B.敲除菌株A基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的pck基因，得到缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的菌株B；
[0010]C.增强菌株B的基因组中编码天冬氨酸激酶的基因lysC的表达，得到过表达天冬氨酸激酶的菌株C；
[0011]D.增强菌株C的基因组中编码转酮醇酶基因tkt、编码酪氨酸解氨酶基因tal和编码6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因zwf的表达，得到氧化磷酸化途径增强的菌株D；
[0012]E.在菌株D基因组中二氨基丙酸脱氢酶的编码基因ddh位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因(即ectA、ectB和ectC，简写ECT)，得到依克多因合成途径增强的菌株E；
[0013]F.在菌株E基因组中噬菌体转座酶IS30基因位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，得到依克多因合成途径进一步增强的菌株F，筛选阳性克隆，得到依克多因生产菌。
[0014]优选地，上述的方法还包括在基因组中叠加整合ectABC基因的下述步骤：
[0015]G.在步骤F所得菌株F的基因组中进一步整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，筛选依克多因合成途径增强的阳性克隆。
[0016]在一种实施方式中，步骤A中所述出发菌株是Corynebacterium glutamicum ATCC13032 LysC
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。该菌株可按照文献Biotechnol.J.2019,14,1800417.报道的方法构建得到。
[0017]上述步骤A中hom基因的敲减可以通过使hom基因发生T176C突变而实现，高丝氨酸激酶发生T176C突变后酶活力会发生降低。
[0018]例如，hom基因发生T176C突变的步骤为：将核苷酸序列为SEQ ID NO:4的质粒pK18mobSacB
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homT176C导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆。
[0019]上述步骤B中pck基因的敲除可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的质粒pK18mobSacB
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KOpck导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆。
[0020]上述步骤C中的基因lysC表达的增强可以通过将lysC基因置于sod启动子下游而实现。例如，可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的质粒pK18mobSacB
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Psod
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lysC导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆。
[0021]上述步骤D中的基因tkt、tal和zwf表达的增强可以通过用sod启动子替换其天然
启动子而实现。例如，可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:3的质粒pK18本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建依克多因生产菌的方法，其包括以下步骤：A.以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，敲减基因组中编码高丝氨酸激酶的hom基因，得到下调高丝氨酸激酶表达的菌株A；B.敲除菌株A基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的pck基因，得到缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的菌株B；C.增强菌株B的基因组中编码天冬氨酸激酶的基因lysC的表达，得到过表达天冬氨酸激酶的菌株C；D.增强菌株C的基因组中编码转酮醇酶tkt的基因tkt、编码酪氨酸解氨酶tal的基因tal和编码6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶zwf的基因zwf的表达，得到氧化磷酸化途径增强的菌株D；E.在菌株D基因组中二氨基丙酸脱氢酶的编码基因ddh位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，得到依克多因合成途径增强的菌株E；F.在菌株E基因组中噬菌体转座酶IS30基因位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，得到依克多因合成途径进一步增强的菌株F，筛选阳性克隆，得到依克多因生产菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：G.在步骤F所得菌株F的基因组中进一步整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，筛选依克多因合成途径增强的阳性克隆。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述出发菌株是Corynebacterium glutamicum ATCC13032 LysC
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。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中hom基因的敲减通过使...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，刘映淼，高书良，杨海锋，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：