构建谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建谷胱二肽生产菌的方法，包括以下步骤：在酿酒酵母菌基因组中整合入一个以上拷贝的γ

【技术实现步骤摘要】
构建谷氨酸
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半胱氨酸二肽生产菌的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种产谷胱二肽的酿酒酵母工程菌的构建方法。

技术介绍

[0002]谷氨酸
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半胱氨酸二肽又称γ
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L
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谷氨酰基
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L
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半胱氨酸、γ
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Glu
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Cys，简称谷胱二肽，其CAS号636
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58
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8，分子式如下。
[0003][0004]谷胱二肽是人体内与甘氨酸通过谷胱甘肽合成酶(gshB)合成L
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谷胱甘肽(GSH)的底物，人体细胞内谷胱二肽含量很低，但人体细胞可以从外源摄取谷胱二肽快速提升GSH的水平。天然食物中，谷胱二肽一般在牛奶中存在，特别是乳清成分中，其往往以二硫键的形式连接到蛋白上。临床研究证明，HIV病人通过摄取乳清蛋白提取物可以提升人体谷胱甘肽水平。乳清提取物的谷胱二肽已经用于添加到食品和化妆品，也用来治疗遭受重金属或氧化剂中毒的病人。
[0005]目前谷胱二肽的合成方法包括化学合成法和酶催化法，但是目前还没有可以工业化进行稳定、低成本生产谷胱二肽的方法，化学法涉及复杂的保护和去保护修饰，工艺复杂，收率太低；酶法，一般需要使用经过甲醇或乙醇酯化的氨基酸底物作为原料，原料的限制性和可获取性不足，限制了工业化生产。
[0006]也有人研究了采用微生物发酵法来制备谷胱二肽。发酵法采用廉洁易得的培养基中碳源、氮源作为起始原料，近些年来逐渐成为新研究方向，例如CN104164381A公开了利用大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)发酵来制备γ
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谷氨酰半胱氨酸。但目前报道的微生物都是细菌，还没有报道利用真菌比如酵母菌发酵来制备谷胱二肽的研究进展。
[0007]考虑到目前谷胱二肽主要用于食品、药品和化妆品，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过某些细菌特别是有致病性风险的细菌发酵获得的谷胱二肽难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

技术实现思路

[0008]要克服这种市场销售障碍，提高谷胱二肽被食品、保健品和药品销售商和消费者的接受度，专利技术人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等作为菌种通过发酵来生产谷胱二肽的可行性，终于在酿酒酵母中取得了成功，尤其是开发出了通过发酵生产谷胱二肽、但不生产谷胱甘肽的酿酒酵母S288C工程菌，
这些研究进展构成了本专利技术的基础。
[0009]本专利技术的第一个目的在于提供一种构建谷氨酸
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半胱氨酸二肽(简称谷胱二肽)生产菌的方法，其包括以下步骤：
[0010]A.在酵母菌基因组中整合入一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.2，又称glutamate
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cysteine ligase，谷氨酰半胱氨酸连接酶)基因gshA，筛选阳性克隆；
[0011]B.筛选得到生产谷氨酸
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半胱氨酸二肽(谷胱二肽)的酵母菌。
[0012]上述酵母菌可以选自酿酒酵母和面包酵母。
[0013]优选地，上述酵母菌是酿酒酵母S288C。
[0014]在一种实施方式中，上述γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶可以是大肠杆菌来源的gshA酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0015]为了在酵母菌例如酿酒酵母中表达外源的大肠杆菌来源的gshA酶，对其编码基因进行密码子优化，例如上述基因gshA的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:2。
[0016]上述步骤A中可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将基因gshA整合入酵母菌基因组。
[0017]上述基因编辑技术可以采用CRISPR
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Cas9系统、CRISPR
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Cpf1系统、CRISPR
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Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
[0018]上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertion of transposable elements by guide RNA
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assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR
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associated transposase，CRISPR相关转座酶)。
[0019]本专利技术的第二个目的在于提供一种谷氨酸
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半胱氨酸二肽生产菌或称谷胱二肽生产菌，其通过上述的方法构建得到。
[0020]本专利技术的第三个目的在于提供上述的谷氨酸
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半胱氨酸二肽生产菌在生产谷胱二肽中的应用。具体而言，通过上述谷胱二肽生产菌菌株的发酵来生产谷胱二肽。
[0021]其中，发酵培养基可以是如下组成的YPD
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GC培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，根据需要在发酵培养至48h，添加1wt％的谷氨酸和1.5wt％半胱氨酸。
[0022]按照酿酒酵母的生长习性，发酵温度是30℃左右。
[0023]本专利技术构建的酿酒酵母工程菌是一种公认的安全模式微生物，能够通过发酵直接产生谷胱二肽、但不生产谷胱甘肽，所得到的发酵产物易于被广大食品、保健品和药品销售商和消费者所接受，具有工业化开发利用价值。
附图说明
[0024]图1是本专利技术构建的质粒pET24a
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gshA
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SC图谱。
[0025]图2是pHCas9
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Nours质粒图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0026]图3是pYES2
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gRNA
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hyg质粒图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
具体实施方式
[0027]γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(gshA)可催化L
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谷氨酸和L
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半胱氨酸，依靠ATP供能，
生成谷胱二肽(γ
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GC)。进一步地，谷胱二肽和甘氨酸可以在谷胱甘肽合成酶(gshB)催化下合成谷胱甘肽(GSH)。
[0028]专利技术人通过基因编辑技术CRISPR
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Cas9系统在宿主酿酒酵母S288C基因组中整合入一个以上拷贝的γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶gshA基因，筛选得到能产生谷胱二肽的工程菌。出乎预料的是，该工程菌能只产生谷胱二肽、但不再进一步产生谷胱甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建谷氨酸
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半胱氨酸二肽生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.在酵母菌基因组中整合入一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.2)基因gshA，筛选阳性克隆；B.筛选得到生产谷氨酸
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半胱氨酸二肽的酵母菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌选自酿酒酵母和面包酵母。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酵母菌是酿酒酵母S288C。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶是大肠杆菌来源的gshA酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，杨海锋，高书良，丁鹏，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：