一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母及其构建方法与应用，所述重组毕赤酵母是通过在毕赤酵母GS115的基因组表达岩藻糖

【技术实现步骤摘要】
IDNO.1所示，所述岩藻糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶来源于野猪(Sus scrofa)的 FPGT基因，所述岩藻糖激酶基因来源于野猪(Sus scrofa)的FCSK基因。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列如SEQ ID NO.3 所示，所述岩藻糖激酶的表达序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述载体的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本专利技术第一方面所述的表 达载体，其中所述细胞为非植物细胞。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞为毕赤酵母。
[0015]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述细胞为毕赤酵母GS115。
[0016]本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第二方面所述的重组细胞的构建方法，包括以下步骤： 将本专利技术第一方面所述载体转入细胞中。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述构建方法具体为将本专利技术第一方面所述载体电转化毕 赤酵母GS115的感受态细胞。
[0018]本专利技术的第四个方面，提供本专利技术第一方面所述的载体或本专利技术第二方面所述重组细胞 的应用。
[0019]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述应用具体为在制备鸟苷二磷酸岩藻糖中的应用。
[0020]本专利技术的第五个方面，提供一种制备鸟苷二磷酸岩藻糖的方法，通过本专利技术第二方面所 述的重组细胞生成。
[0021]在本专利技术的一些实施方式，所述发酵条件为将重组细胞种子液以OD600值为0.5～1.5的 接种量接入发酵培养基，在25～35℃，200～300rpm条件下培养100～140h。
[0022]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述发酵条件为将重组细胞种子液以OD值为1的接 种量接入发酵培养基，在30℃，250rpm条件下培养120h。
[0023]本专利技术还提供一种鸟苷二磷酸岩藻糖，由本专利技术第五方面所述的方法制备而成。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术提供了一种载体，所述载体含有岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列和/或岩藻糖 激酶的表达序列。并且提供了一种重组细胞，是在毕赤酵母GS115的基础上表达岩藻糖
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磷 酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶基因得到的，通过改造获得了可合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组菌 株。本专利技术重组毕赤酵母的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
[0026]图1为鸟苷二磷酸岩藻糖生物合成示意图。
[0027]图2为本专利技术实施例1合成鸟苷二磷酸岩藻糖质粒示意图。
[0028]图3为本专利技术实施例1中质粒转化表达FPGT和FCSK基因的酵母菌落PCR验证琼脂糖 凝胶电泳图。
[0029]图4为本专利技术实施例2中的高效液相色谱图。
[0030]图5为本专利技术实施例2中的质谱图。
具体实施方式
[0031]以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地 理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不 是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获 得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。
[0032]高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent，UV检测器，C18柱(250
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4.6mm，5μm)，流动相 A：20mM pH6.0三乙胺乙酸缓冲液(TEAA)，流动相B：乙腈，流速0.35mL/min，柱温40℃， 进样体积为10μL。
[0033]实施例1重组毕赤酵母的构建
[0034]根据NCBI上公布的野猪[Sus scrofa(pig)]的岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶(FPGT)和岩藻糖 激酶(FCSK)的序列，其中岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶基因在NCBI上的Gene ID：100513664， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；岩藻糖激酶基因在NCBI上的Gene ID：100625448，其 序列如SEQ ID NO.2所示，上述两基因均按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化。其优化后的 岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，岩藻糖激酶的碱基序列如SEQID NO.4所示；通过酶切连接，构建序列如SEQ ID NO.5所示的重组质粒。其质粒示意图如 图2所示。
[0035]其中：
[0036]SEQ ID NO.5：NO.5：
[0037][0038][0039][0040][0041][0042][0043][0044]在SEQ ID NO.5中“_”为基因FPGT区域，“～”为FCSK区域，
“…”
为启动子区域。
[0045]将构建好的重组质粒电转化重组毕赤酵母GS115的感受态细胞，重组质粒的添加量为 800～1500ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5.6ms，30℃复苏1.5h，涂布终浓度为100mg/L 博莱霉素抗性的YPDZ平板，30℃培养96h，挑选若干单菌落。
[0046]通过博莱霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确证岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶(FPGT) 和岩藻糖激酶(FCSK)成功整合到酵母基因组。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图3所示，其中条 带1、2、3、4、5均为菌落样品，M为Marker。可以看出菌落PCR验证有特殊条带，证明岩 藻糖
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磷酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶成功整合的毕赤酵母GS115基因组中。确认野猪来源的 岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶表达成功，得到重组毕赤酵母GS115。
[0047]实施例2发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
[0048]将实施例1中重组毕赤酵母制成种子液，种子液培养基的配方为：甘油10g/L、胰蛋白胨 10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养 基中，培养24h。
[0049]将种子液以OD值为1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨 20g/L、酵母粉10g/L、1.34％YNB；10％10
×
pH6.0磷酸缓冲液，于30℃、250rpm条件下培养 120h，每隔24h流加1％碳源，碳源为甲醇，在发酵48h后每隔24h向培养基中添加1g/L岩 藻糖至发酵结束。
[0050]发酵结束后，使用高效液相色谱测定发酵细胞中的鸟苷二磷酸岩藻糖，结果如图4所示， 并通过质谱进一步确证，结果如图5所示，鸟苷二磷酸岩藻糖的含量为289.8mg/L。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种载体，其特征在于，所述载体含有岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列和/或岩藻糖激酶的表达序列。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述岩藻糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所示的载体，其特征在于，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列如SEQ ID NO.3所示，所述岩藻糖激酶的表达序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所示的载体，其特征在于，所述载体的序列如SEQ ID NO.5所示。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：段烨红，梁书利，林影，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：