用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株。所述表达载体包括串联的分子伴侣基因BIP和PDI，或者串联的分子伴侣基因VHB和PDI，或者串联的分子伴侣基因HACI和PDI。将经基因工程改造筛选得到的包含上述表达载体的耐高温植酸酶高酶活表达菌株V28

【技术实现步骤摘要】
用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体、菌株


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及用于提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达 的分子伴侣表达载体、菌株。

技术介绍

[0002]谷类、豆科类等作物是食品和动物饲料的主要原料。原料中50％～70％的磷是 以植酸磷的形式存在。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率较低，造 成大量磷的浪费和污染。
[0003]植酸酶能将植酸水解成肌醇和磷酸，在饲料中添加植酸酶不仅可以提高饲料中 磷的利用率、减少粪便中磷对环境的污染，还可以降低植酸盐的抗营养作用，增加 动物对蛋白质和微量元素的吸收能力，是必不可少的饲料添加剂。高的发酵酶活和 优良的耐热性是植酸酶在饲料行业高效应用的前提和保障，因此，从自然界寻找或 通过分子改造等方法筛选高酶活的耐高温植酸酶成为目前饲料行业研究的热点。目 的蛋白与分子伴侣共表达是提高目标蛋白表达量的重要手段之一，也是提高植酸酶 酶活的非常重要的途径。
[0004]分子伴侣又称辅助蛋白，它是一类细胞内对蛋白质翻译、转运、折叠及修饰都 具有重要作用的蛋白质分子。大量研究表明分子伴侣对外源蛋白的分泌表达有着重 要意义，其主要作用是辅助蛋白质的正确折叠，减少由于蛋白质错误折叠而导致的 降解，从而提高蛋白质的分泌表达。分子伴侣主要来源于哺乳动物、原核和真核细 胞，少数来源于植物。分布的器官主要有内质网、细胞质、细胞核、胞浆以及线粒 体和叶绿体。
[0005]巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一种相对简单的真核表达系统，可以对外源重 组蛋白质进行正确的折叠加工、糖基化修饰等，使用AOX1强启动子，以甲醇作为 碳源，实现了多种外源蛋白的高效表达，因而在外源蛋白表达领域得到广泛的利用。 研究表明，不同的外源蛋白在毕赤酵母表达系统中表达时有不同的折叠蛋白响应效 应和翻译后修饰的机制。
[0006]目前文献报道中，常用的分子伴侣有BIP、二硫键异构酶PDI(Protein disulfideisomerase)、EROI、内质网响应蛋白HACI、透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin gene VHb)、SSAI等。
[0007]Bip是最重要的Hsp70伴侣蛋白，是ER功能的主要调节者之一，对维持内质网 的稳态必不可少，对促进蛋白质的正确折叠至关重要。Bip具有ATP酶活性，Bip与 特定的内质网定位蛋白ERdjs相互作用，刺激Bip与底物结合。
[0008]当蛋白高水平表达时，未经折叠的蛋白质容易于内质网中错误折叠和累积，内 质网主要通过UPR进行调控，UPR激活调控因子HACI，可促进UPR相关蛋白质 及分子伴侣的高水平表达，介导蛋白质的正确折叠和分泌，将内质网中错误折叠的 蛋白进行降解等。
[0009]EROI在内质网中将还原态的蛋白二硫键异构酶PDI修饰成氧化态，PDI的氧 化活性帮助蛋白形成正确的折叠结构而分泌到胞外，对内质网腔内蛋白质二硫键的 形成具有
促进作用，且EROI、PDI两种分子伴侣都负责内质网氧化蛋白的折叠。分 子伴侣如PDI1，也属于蛋白二硫化物异构酶，是内质网腔中多功能分子伴侣。
[0010]二硫键异构酶PDI(Protein disulfide isomerase)主要位于内质网中，是一种重 要的折叠催化剂，特别是对含二硫键的蛋白的折叠发挥重要的作用。PDI同时具有氧 化活性和异构活性，既能帮助蛋白质形成二硫键，又能使错误配对的二硫键进行重 新排列。
[0011]分子伴侣在基因工程菌中具有广泛的应用。不同蛋白在毕赤酵母中表达时对分 子伴侣具有选择性，杜济良研究了10种不同定位的分子伴侣对外源蛋白葡聚糖酶 (EXG1)在巴斯德毕赤酵母中表达的影响，结果表明BIP、EROI、PDI、HACI在 外源蛋白葡聚糖酶(EXG1)表达过程中有重要作用，其中BIP共表达菌株使EXG1 的表达量提高了2倍。目前文献报道中主要是目标蛋白与单独的分子伴侣进行共表 达，极少数与多种分子伴侣同时进行共表达，且表达量提高不显著。闵琪等采用简 单串连的方式将HACI与不同的分子伴侣分别进行组合，与甘露聚糖酶进行共表达， 结果发现这些分子伴侣组合没有显著提高甘露聚糖酶的表达量，且分子伴侣组合效 果均比单一的HACI的效果差。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的是提供一种提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达 载体。
[0013]本专利技术的再一目的是提供能够高效表达植酸酶的重组菌株。
[0014]本专利技术的再一目的是提供利用提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的方法。
[0015]根据本专利技术的提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，所述 表达载体包括串联的分子伴侣基因BIP和PDI，或者串联的分子伴侣基因VHB和PDI，或者串联的分子伴侣基因HACI和PDI。
[0016]根据本专利技术的提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，其中， 分子伴侣基因BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因PDI的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，分子伴侣基因VHB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，分 子伴侣基因HACI的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0017]SEQ ID NO：1
[0018]Atgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccatttgctaaacctgttagagctgacgatgtc gaatcttatggaacagtgattggtatcgatttgggtaccacgtactcttgtgtcggtgtgatgaagtcgggtcgtgtagaaattcttgctaatgaccaaggt aacagaatcactccttcctacgttagtttcactgaagacgagagactggttggtgatgctgctaagaacttagctgcttctaacccaaaaaacaccatctt tgatattaagagattgatcggtatgaagtatgatgccccagaggtccaaagagacttgaagcgtcttccttacactgtcaagagcaagaacggccaac ctgtcgtttctgtcgagtacaagggtgaggagaagtctttcactcctgaggagatttccgccatggtcttgggtaagatgaagttgatcgctgaggacta cttaggaaagaaagtcactcatgctgtcgttaccgttccagcctacttcaacgacgctcaacgtcaagccactaaggatgccggtctcatcgccggttt gactgttctgagaattgtgaacgagcctaccgccgctgcccttgcttacggtttggacaagactggtgaggaaagacagatcatcgtctacgac本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，其特征在于，所述表达载体包括串联的分子伴侣基因BIP和PDI，或者串联的分子伴侣基因VHB和PDI，或者串联的分子伴侣基因HACI和PDI。2.根据权利要求1所述的提高植酸酶在毕赤酵母中的分泌表达的分子伴侣表达载体，其特征在于，所述分子伴侣基因BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述分子伴侣基因PDI的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述分子伴侣基因VHB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：江民华，李阳源，黄江，何小梅，边叶雨，贺金玲，陈丽芝，陈琼银，黄佳乐，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：