一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶制造技术

本发明专利技术公开了一种黄酮还原酶SEQ ID NO:1，其能够催化槲皮素发生还原反应来制备二氢槲皮素，具有研究开发应用潜力。具有研究开发应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶


[0001]本专利技术属于酶催化领域，具体地说，涉及一种黄酮还原酶及其在制备二氢槲皮素中的用途。

技术介绍

[0002]二氢槲皮素是从落叶松、花旗松等松科植物中提取出来的一种天然活性物质，属于生物黄酮类拟维生素P，学名二氢槲皮素，英文名有Dihydroquercetin、Taxifolin等，分子式为C15H12O7，分子量304.25，具有重要的抗酪氨酸酶活性、抗纤维化、抗氧化能力和胶原酶活性抑制能力等。
[0003][0004]目前二氢槲皮素主要的制备方法有植物提取法和发酵法，尚未见酶催化方法的报道。2020年，江南大学高松等在《生物工程学报》报道了来源于水飞蓟转录组中鉴定得到一个黄酮3
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羟化酶SmF3H(Flavone 3
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hydroxylase，F3H)，组合SmF3
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H(Flavone 3
’‑
hydroxylase，F3
’
H)和cytochrome P450 reductases(CPR)，以柚皮素为底物制备二氢槲皮素，在摇瓶中产量达到695.90mg/L；在5
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L发酵罐上以柚皮素为底物发酵得到3.54g/L二氢槲皮素。同年，江南大学李广建等在“Journal of Agricultural and Food Chemistry”中报道了以葡萄糖或者柚皮素制备二氢杨梅素，通过多拷贝整合可以获得菌株以2.5g/L naringenin为底物可产709.6mg/L二氢杨梅素和670.68mg/L二氢槲皮素，以葡萄糖为底物可产246.4mg/L二氢杨梅素和114.1mg/L二氢槲皮素。

技术实现思路

[0005]2021年，中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨高华等在nature communication上报道了一种来源于肠道菌的Flavonifractor plautii ATCC 49531的新型黄酮还原酶(flavone reductase，FLR)(NCBI：WP_009257602.1)，在严格厌氧条件下可以还原黄酮或黄酮醇生成二氢黄酮和二氢黄酮醇。受此启发，我们尝试使用该酶用于还原槲皮素来制备二氢槲皮素，但在有氧条件下，未能合成出二氢槲皮素。作为一种尝试方案，我们考虑对此酶进行定向进化，探索在有氧条件下催化槲皮素还原的可能性，并意外地取得了突破，奠定了本专利技术及后续改进的基础。
[0006]因此，本专利技术的第一个方面提供了一种多肽，所述的多肽选自下组：
[0007](a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽：
[0008]MKILGISGGMRNGSNDGMCIEALMGAKEMGAEVEFIQLQNLHIEHCTGCTACVQSVLGGRGGKCVLKDDFDWLLDKMLDADGIVFSTPIFKKGATGLFHTITDRFGPRMDRGNNIIGTKIAEETSGTAPDPRILKDKVISFMSVGGSDWVTRTQCDAGMLALTPMWKVIDNEVFPWALSILVEDERVARAHQIGRTIAEAAKDIEHAQYQGDAGVCPHCHSRNFHLQDGKAICCLCGLEGEIHNEGGKYSFTFPAEQLEHAHDTLSGKFIHGNDIKENTGKKIANMQTEKYKARQAAYRAFITATVPEKG(SEQ ID NO:1)；
[0009](b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽，所述功能是指催化槲皮素还原为二氢槲皮素的功能；
[0010](c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或
[0011](d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。
[0012]本专利技术的第二个方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸选自：
[0013](A)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；
[0014](B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0015](C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；
[0016](D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多核苷酸；
[0017](E)与(A)
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(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0018]优选地，上述多核苷酸为SEQ ID NO:2。
[0019]本专利技术的另一个方面提供了包含上述多核苷酸的载体、以及转化了所述载体的微生物。
[0020]上述微生物可以选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0021]本专利技术的第四个方面提供了上述多肽、或者上述微生物在制备二氢槲皮素中的用途。
[0022]在制备二氢槲皮素时，例如以槲皮素为底物原料，在上述多肽或者微生物催化下通过还原反应来制备二氢槲皮素。
[0023]优选地，反应体系中还可以添加有NADH特异性FMN氧化还原酶(CAS:9079
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8)，用于将FMN还原为FMNH2，为槲皮素提供还原力生成二氢槲皮素。
[0024]上述反应体系中还可以添加有NADH和FMN(黄素单核苷酸)作为NADH特异性FMN氧化还原酶底物，生成的FMNH2可作为黄酮还原酶辅酶促进对槲皮素的选择性还原反应。其中NADH用于为FMN还原提供还原力，将FMN还原为FMNH2。
[0025]可选地，上述反应体系中还可以添加有DMSO作为槲皮素的助溶剂，以便提高还原反应速度。
[0026]本专利技术公开的多肽SEQ ID NO:1是野生黄酮还原酶(NCBI：WP_009257602.1)的突变体，但是改变了野生酶原有的功能，能够催化槲皮素还原为二氢槲皮素，从而开辟出酶催化法制备二氢槲皮素的新方法。尤其是在有氧条件下也能进行体外催化槲皮素还原，这给二氢槲皮素的合成工艺带来了极大便利，值得进一步深入研究进化。
附图说明
[0027]图1是表达野生黄酮还原酶的质粒pET24a
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FLR结构图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
具体实施方式
[0028]本专利技术通过对野生黄酮还原酶(SEQ ID NO:3)进行突变，实现了其催化功能的改变，获得的E91K/G125S/N196T突变体能够将槲皮素作为底物进行还原反应并得到预期的产物二氢槲皮素。
[0029]在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:3的来源于肠道菌Flavonifractor plautii ATCC 49531的黄酮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽，所述的多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽，所述功能是指催化槲皮素还原为二氢槲皮素的功能；(c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。2.多核苷酸，所述的多核苷酸选自：(A)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，刘映淼，高书良，施鑫磊，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：