固氮酶蛋白变体制造技术

本公开提供了具有改进的稳定性的NifD蛋白变体，其在氨基酸位置98处具有突变。本公开还涉及包含所述NifD蛋白变体的固氮酶系统，和包含所述NifD蛋白变体或固氮系统的宿主细胞。本公开还提供了经修饰以表达真核生物线粒体信号肽酶(MPP)的大肠杆菌细胞及其在测试蛋白质的稳定性中的用途。质的稳定性中的用途。质的稳定性中的用途。

【技术实现步骤摘要】
固氮酶蛋白变体
[0001]本申请要求于2020年06月05日递交的申请号为CN 202010508041.7的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。


[0002]本公开属于生物工程领域，并涉及固氮酶系统NifD蛋白的变体，其相比于亲本NifD蛋白具有改进的稳定性。本公开还涉及包含该NifD蛋白变体的固氮酶系统，以及包含该NifD蛋白变体或固氮酶系统的宿主细胞。本公开还提供了经修饰以表达真核生物线粒体信号肽酶(MPP)的大肠杆菌细胞及其在测试蛋白质的稳定性中的用途。
技术背景
[0003]通过改造非豆科植物而使其能够自主固氮，可以大大减少农业生产中工业氮肥的使用，这可以通过将生物固氮系统导入植物靶细胞器例如线粒体来实现，这些有能量转换发生的细胞器有潜力提供固氮所需的还原力和ATP。近年来，一些尝试将固氮酶导入真核细胞器的研究表明，线粒体是在真核生物中异源表达固氮酶的合适位置(Lopez
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Torrejon G,et al.(2016)Expression of a functional oxygen
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labile nitrogenase component in the mitochondrial matrix of aerobically grown yeast.Nat Commun 7:11426)。
[0004]固氮酶系统包含多个组分。其催化亚基由两种金属蛋白组成：由nifH编码的铁蛋白(Fe蛋白)和由nifDK编码的钼铁蛋白(MoFe蛋白)。除了nifHDK编码的核心酶之外，活性固氮酶的生物合成还需要金属原子簇组分，包括[Fe4S4]簇、P簇和FeMoco。Fe蛋白的组装依赖于成熟酶NifM以及由NifU和NifS提供的一个[Fe4S4]簇，该金属原子簇连接两个NifH亚基。MoFe蛋白的成熟需要在α亚基(NifD)和β亚基(NifK)的界面加入P簇([Fe8S7])，也需要FeMoco[Mo
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7Fe
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9S
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C
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高柠檬酸]整合在α亚基上来促进NifDK四聚体的形成。FeMoco作为生物系统中最复杂的金属原子簇，其在体内的生物合成需要九种Nif蛋白：H、E、N、B、U、S、V、Q、Y。P簇的生物合成相对简单，需要NifH以及组装因子NafH、NifW和NifZ。除上述蛋白外，还需要额外的蛋白为固氮酶提供电子。在产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)中，这一功能是由黄素氧化还原蛋白NifF和丙酮酸
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黄素氧化还原酶NifJ来完成的。
[0005]在烟草(Nicotiana benthamiana)中使用瞬时表达系统表达靶向线粒体基质的固氮酶系统Nif蛋白时，来源于产酸克雷伯菌的16种Nif蛋白(B、D、E、F、H、J、K、M、N、Q、S、U、V、X、Y、Z)都可以被检测到(Allen RS,et al.(2017)Expression of 16Nitrogenase Proteins within the Plant Mitochondrial Matrix.Frontiers in Plant Science 8(287))。然而在这种条件下，NifD蛋白不能够以稳定的形式高表达。此外，来源于棕色固氮菌的9个基因nifHDKUSMBEN能够以基因簇的形式实现在酵母线粒体中的表达(Bur
é
n S,et al.(2017)Formation of Nitrogenase NifDK Tetramers in the Mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.ACS Synthetic Biology 6(6):1043
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1055)，但由于NifD在酵母线粒体中表达不稳定，只能检测到少量从酵母线粒体中纯化的NifDK四聚体。这些研究都表明，在真核细胞的细胞器中实现其自主固氮是可行的，但NifD蛋白在粒体中的不稳定性
成为了获取活性固氮系统的限制瓶颈。
[0006]因此，本领域中对于具有改进稳定性的NifD蛋白以构建稳定可用的固氮酶系统存在需要。

技术实现思路

[0007]本专利技术人在NifD蛋白序列上确定了涉及其在线粒体中稳定性的关键氨基酸残基NifD
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R98(精氨酸)。通过蛋白序列分析，发现R98位点在不同来源的固氮菌的NifD蛋白上具有高度的保守性，由R98介导的NifD蛋白降解在真核线粒体中是普遍存在的。基于以上发现，本专利技术人构建了一系列NifD
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R98突变体，其能够在不同类型的宿主细胞的线粒体中稳定表达，同时获得高固氮酶活性水平。
[0008]相应的，在一方面本公开涉及NifD蛋白变体，所述变体相对于亲本NifD蛋白在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置R98对应的位置处具有突变。如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列是来自产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)的示例性野生型NifD蛋白的氨基酸序列。
[0009]Klebsiella oxytoca NifD(SEQ ID NO:1)
[0010]MMTNATGERNLALIQEVLEVFPETARKERRKHMMVSDPEMESVGKCIISNRKSQPGVMTVRGCAYAGSKGVVFGPIKDMAHISHGPVGCGQYSRAGRRNYYTGVSGVDSFGTLNFTSDFQERDIVFGGDKKLSKLIEEMELLFPLTKGITIQSECPVGLIGDDISAVANASSKALDKPVIPVRCEGFRGVSQSLGHHIANDVVRDWILNNREGQPFETTPYDVAIIGDYNIGGDAWASRILLEEMGLRVVAQWSGDGTLVEMENTPFVKLNLVHCYRSMNYIARHMEEKHQIPWMEYNFFGPTKIAESLRKIADQFDDTIRANAEAVIARYEGQMAAIIAKYRPRLEGRKVLLYMGGLRPRHVIGAYEDLGMEIIAAGYEFAHNDDYDRTLPDLKEGTLLFDDASSYELEAFVKALKPDLIGSGIKEKYIFQKMGVPFRQMHSWDYSGPYHGYDGFAIFARDMDMTLNNPAWNELTAPWLKSA
[0011]在本公开中，术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用并且通常指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，并且不限制产物的最小长度。因此，上述术语包含肽、寡肽、多肽、二聚体(异源和同源)，多聚体(异源和同源)等等。“蛋白”和“多肽”涵盖了全长蛋白质及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本专利技术的目的，“蛋白”和“多肽”还指对天然蛋白质或多肽的氨基酸序列的修饰如缺失、添加、插入和取代(例如保守氨基酸取代)后所得的变体。例如，蛋白质和多肽可以指天然蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.NifD蛋白变体，所述变体相对于亲本NifD蛋白在与SEQ ID NO:1的氨基酸位置R98对应的位置处具有突变。2.权利要求1的变体，其中所述突变为选自下组的氨基酸取代：R98P、R98H、R98N、R98Q、R98M、R98A、R98T、R98C、R98I和R98L，优选所述氨基酸取代选自R98P、R98H和R98N。3.权利要求1或2所述的变体，其中所述亲本NifD蛋白选自棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)NifD蛋白，产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)NifD蛋白、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)NifD蛋白和蓝细菌(Anabaena sp.PCC7120)NifD蛋白。4.权利要求1或2所述的变体，其中所述亲本NifD蛋白具有选自SEQ ID NO:1
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4中任一项所示的氨基酸序列。5.权利要求1
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4中任一项所述的变体，其中所述变体与所述亲本NifD蛋白具有至少80％的序列同一性，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，优选所述变体相对于所述亲本NifD蛋白进行了1
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20个氨基酸突变，例如1
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10个氨基酸突变或1
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5个氨基酸突变。6.钼铁蛋白(MoFe蛋白)，其包含权利要求1
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5中任一项所述的NifD蛋白的变体和NifK蛋白，以及任选的金属原子簇组分。7.钼铁蛋白，其包含NifD蛋白中的R98D突变和NifK蛋白中的D516R突变。8.权利要求7的钼铁蛋白，其中所述钼铁蛋白来源于选自以下的物种：棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和蓝细菌(Anabaena sp.PCC7120)。9.固氮酶系统，所述固氮酶系统包含如权利要求1
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5中任一项所述的NifD蛋白的变体和选自NifH、NifK、NifY、NifE、NifN、NifX、NifB、NifU、NifS、NifV、NifM、NifJ、NifF、NifT、NifX、NifQ、NifW和NifZ的一种或多种蛋白，优选所述固氮系统包含所述NifD蛋白的变体和NifH、NifK、NifY、NifE、NifN、NifX、NifB、NifU、NifS、NifV、NifM、NifJ、NifF、NifT、NifX、NifQ、NifW和NifZ。10.核苷酸序列，其编码权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：相楠，郭琛月，徐昊，瑞，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：