一种耐碱性的精氨酸脱亚胺酶制造技术

本发明专利技术提供了一种耐碱性的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，在以L

【技术实现步骤摘要】
一种耐碱性的精氨酸脱亚胺酶


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体地说，涉及一种耐碱性的用于合成L
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瓜氨酸的精氨酸脱亚胺酶。

技术介绍

[0002]L
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瓜氨酸是一种α
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氨基酸，1914年，日本研究人员高贺洋太郎(Yotaro Koga)和小田龙夫(Ryo Odake)首次从西瓜中分离出来，因此被称为瓜氨酸。迄今为止，人们已成功从西瓜汁、野西瓜叶、核桃仁、核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸。L
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瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，它是尿素循环的关键中间体，哺乳动物通过将氨转化为尿素来排泄氨。
[0003][0004]国外科学家在瓜氨酸生理活性及生产制备方面的研究较多，尤其是在日本、美国和欧洲。在瓜氨酸的生理功能方面，已发现瓜氨酸具有一些很重要的药理功能，例如自由基清除作用，在人体的健康保健方面具有很重要的意义；血管舒张作用，这有望成为治疗内毒症、脓毒症的良药。日本科学家已研制出一种含瓜氨酸新多肽，并将该新多肽开发成抗艾滋病药物。瓜氨酸还被认为是一种非常有效的抗氧化剂，这一功能已应用于化妆品、药物、保健食品等各个领域。近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。
[0005]L
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瓜氨酸的制备方法主要有三种，化学法、发酵法和酶催化法。其中化学法是碱性条件下水解L
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精氨酸得L
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瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D
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瓜氨酸，影响产品质量，而且生产过程中产生大量废水，污染环境，目前已被逐渐淘汰。发酵法目前有较多的报道，但生产规模较小。目前主流的生产工艺为L
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精氨酸通过精氨酸脱亚胺酶制备L
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瓜氨酸。L
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精氨酸是一种碱性氨基酸，水溶液碱性较高，高浓度精氨酸水溶液通常达到pH 11以上，一般需要用盐酸或硫酸中和到中性才能进行酶催化，否则酶不具催化活性或活性很低，这会大大增加生产和后处理工艺成本。

技术实现思路

[0006]为了克服现有酶催化技术的上述缺陷，专利技术人尝试对能催化L
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精氨酸反应的精氨酸脱亚胺酶(ADI)进行突变筛选，最终得到了耐碱性环境(pH 9以上、甚至pH 11以上)的突变体，能催化L
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精氨酸中的亚胺基氧化反应、但不改变手性中心(α位)的立体构型。通过多轮定向进化，获得一株高耐受pH的精氨酸脱亚胺酶，可以在精氨酸浓度不低于100g/L的水溶液下直接进行催化反应，大大节省了生产成本。具体地，本专利技术包括如下技术方案。
[0007]一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其为选自下组的多肽：
[0008](1)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
[0009](2)与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且pH值在pH 11以上环境中酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
[0010]MNNGINVNSEIGKLKSVLLHRPGAEVENITPDTMKQLLFDDIPYLKIAQKEHDFFAQTLRDNGAETVYIENLATEVFEKSSETKEEFLSHLLHEAGYRPGRTYDGLTEYLTSMSTKDMVEKIYAGVRKNEFDNKRTALSDMAGSDAKNYFYLNPLPNAYFTRDPQASMGVGMTINKMTFPARQPESLITEYVMANHPRFKDTPIWRDRNHTTRIEGGDELILNKTTVAIGVSERTSSKTIQNLAKELFANPLSTFDTVLAVEIPHNHAMMHLDTVFTMINHDQFTVFPGIMDGAGNINVFILRPGKDDEVEIEHLTDLKAALKKVLNLSELDLIECGAGDPIAAPREQWNNGSNTLAIAPGEIVTYDRNYVTVELLKEHGIKVHEILSSELGRGRGGARCMSQPLWREDL(SEQ ID NO:3)。
[0011]该突变体SEQ ID NO:3为野生酶SEQ ID NO:1(GenBank:CP010050.1)第131位L(亮氨酸)替换为F(苯丙氨酸)、第133位I(异亮氨酸)替换为N(天冬酰胺)、第147位E(谷氨酸)替换为K(赖氨酸)、第351位D(天冬氨酸)替换为N(天冬酰胺)的突变体：
[0012]MNNGINVNSEIGKLKSVLLHRPGAEVENITPDTMKQLLFDDIPYLKIAQKEHDFFAQTLRDNGAETVYIENLATEVFEKSSETKEEFLSHLLHEAGYRPGRTYDGLTEYLTSMSTKDMVEKIYAGVRKNELDIKRTALSDMAGSDAENYFYLNPLPNAYFTRDPQASMGVGMTINKMTFPARQPESLITEYVMANHPRFKDTPIWRDRNHTTRIEGGDELILNKTTVAIGVSERTSSKTIQNLAKELFANPLSTFDTVLAVEIPHNHAMMHLDTVFTMINHDQFTVFPGIMDGAGNINVFILRPGKDDEVEIEHLTDLKAALKKVLNLSELDLIECGAGDPIAAPREQWNDGSNTLAIAPGEIVTYDRNYVTVELLKEHGIKVHEILSSELGRGRGGARCMSQPLWREDL(SEQ ID NO:1)。
[0013]本专利技术的第二个方面提供了编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体的基因。
[0014]优选地，编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以为核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
[0015]本专利技术还提供了包含上述基因的质粒。上述质粒可以是pSH质粒或者pET载体例如pET22b、pET24a、pET28a。
[0016]本专利技术还提供了表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的微生物，例如是基因组中整合了编码上述精氨酸脱亚胺酶突变体SEQ ID NO:3的基因例如SEQ ID NO:4，或者是转化了上述质粒的工程菌。
[0017]本专利技术的另一个方面提供了用于表达上述精氨酸脱亚胺酶突变体的微生物，其基因组中整合了上述突变体的编码基因，或者转化了上述的质粒。
[0018]在一种实施方式中，可通过基因编辑技术将上述突变体的基因整合于宿主微生物细胞的基因组上，所述基因编辑技术选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR
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Cas9系统，CRISPR
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Cpf1系统，CRISPR
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Cas12系统，CRISPR<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精氨酸脱亚胺酶突变体，其为选自下组的多肽：(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；(2)与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且pH值在pH 11以上环境中酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。2.编码如权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的基因为SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。4.包含如权利要求3所述基因的质粒。5.一种用于表达如权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求3所述的基因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，刘映淼，施鑫磊，黎肖平，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：