体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术第一方面提供了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：(1)建立标准曲线，建立标准蛋白质量浓度与发光值关系的标准曲线；(2)构建包含目标蛋白基因的载体，并获得体外蛋白合成体系；(3)建立目标蛋白浓度与载体浓度的关系曲线；(4)计算定量共表达多种目标蛋白的载体浓度或/及浓度比例；(5)定量共表达目标蛋白。本发明专利技术可根据目标蛋白的模板加入量的比例关系，在同一反应体系中定量共表达合成多种蛋白。本发明专利技术还提供了体外无细胞蛋白合成体系在本发明专利技术方法中的应用，用于多种不同蛋白的定量共表达。

【技术实现步骤摘要】
体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种体外定量共表达多种蛋白的方法及其应用。
技术介绍
荧光蛋白在生物学众多研究领域中有着广泛的应用，基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为活细胞或活体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具。自1992年绿色荧光蛋白基因从水母体内克隆以来，现在已经从很多的海洋生物物种中克隆到了的新的荧光蛋白和改造得到新的突变体，它们能特异地“点亮”生物分子或细胞，并显示出生物分子的活动情况，从而能更有助于我们揭示这些分子或细胞的活动规律及本质。已报道的荧光蛋白光谱分布于整个可见光区，它们被广泛应用于基因的表达调控、蛋白质空间定位与转运、蛋白折叠、信号传导、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等研究领域，荧光蛋白的发现与应用为现代生物学的研究提供了强有力的研究手段。生物技术的进步使得合成生物学家可快速可靠地改造生物体系及设计生产生物大分子，尤其是具备生物学功能的蛋白质大分子的设计生产。在过去多年合成生物学的发展中，主要以细胞作为宿主对蛋白质进行工程化设计，但是在细胞内部进行工程化是费时和困难的。这是因为细胞的生长及适应性过程通常与工程设计目标是不一致的，并且由于活细胞系统的复杂性、基因元件难以标准化、以及细胞膜的阻隔等问题，大大限制了生物组件的改造。这些限制使人们试图探索新的发展方向，因而推动了一门新兴的工程技术学科的发展，即无细胞合成生物学。无细胞合成生物学涉及一种新兴技术——无细胞合成体系，也称为体外合成体系，包括体外转录、翻译。无细胞蛋白合成体系是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成。无细胞蛋白合成体系合成表达蛋白质无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤等步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式。基于荧光蛋白的特性，其在生物学研究中发挥着不可替代的重要作用，如何在体外定量共表达多种蛋白是目前面临的一项重要技术问题。经过文献查新检索，未发现采用体外无细胞蛋白合成技术在同一反应体系中进行多种蛋白的定量共表达的报道。本专利技术经过大量的实验探索得出如何通过调整模板DNA的体积或浓度比例来定量共表达多种荧光蛋白，可用于高效的荧光指示分子，用于各种研究或其它用途的荧光标记细胞或生物的研发等。
技术实现思路
本专利技术公开了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，可根据目标蛋白的模板(优选DNA)的浓度用量比例关系，在同一反应体系中定量共表达合成多种蛋白。本专利技术第一方面提供了一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：(1)建立标准曲线。建立各标准蛋白浓度与各自发光值关系的标准曲线。步骤(1)中，根据拟共表达的多种目标蛋白的种类，提供与各目标蛋白相对应的标准蛋白；所述多种目标蛋白各自独立地为一种具有发光功能的蛋白，且所述多种目标蛋白相互之间能够根据所发光性质进行区分，能够实现“无相互干扰”地分别进行检测，从而得以实现对各目标蛋白的定量检测。具体地，步骤(1)所述标准蛋白为目标蛋白的标准样品，可通过合成后分离纯化获得，也可以购买市售分析纯制品。(2)分别构建包含不同目标蛋白基因的载体，以用于分别表达多种不同的目标蛋白。所述“包含目标蛋白基因的载体”，指所述载体中包含所述目标蛋白的编码序列，也可称为“目标蛋白的载体”。比如，“编码GFP蛋白的载体”可以简称为“GFP的载体”。本步骤中，分别构建包含各目标蛋白基因的独立载体，用来分别表达各目标蛋白。针对各目标蛋白分别构建含有其编码序列的独立载体，通过与其相应的独立载体，在共表达体系中进行各自的表达。(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比的定量关系式。将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例加入到一种体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应，也即进行孵育反应，以合成所述多种目标蛋白；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比与所述相应载体的浓度百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致。按不同浓度比例加入所述包含各目标蛋白基因的独立载体时，在所述体外无细胞蛋白合成体系中，多次体外蛋白反应时的载体总浓度保持一致。所述载体总浓度，指所述体外无细胞蛋白合成体系中，所有目标蛋白的载体浓度的总和。(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度及浓度比例。设定拟实现的所述多种目标蛋白的产物浓度比例关系(比如质量浓度比例关系)，作为多种目标蛋白的目标浓度比例关系；通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度及浓度比例。(5)定量共表达多种目标蛋白。根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或/和浓度比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。当所述各目标蛋白的独立载体在各母液中的浓度均相同时，还可以简单地通过体积量或体积比例控制用量。举例如下：一种体外定量共表达多种蛋白的方法，包括以下步骤：第(1)、(2)步与上述一致。第(3)步：建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比或者体积百分比的定量关系式。将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例或者体积比例加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比或者体积百分比与所述相应载体的浓度百分比或者体积百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致。第(4)步：计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度或者载体体积，以及相应的浓度比例或者体积比例。根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度以及浓度比例，或者计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体体积以及体积比例。可以根据步骤(3)所述载体总浓度，计算出各目标蛋白载体所需的浓度以及浓度比例。也可以根据步骤(3)所述载体总浓度以及各载体的母液浓度，计算出各目标蛋白载体所需的体积以及体积比例。当各载体的母液浓度相同时，各目标蛋白载体的浓度比例关系与相应的体积比例关系一致。第(5)步：定量共表达多种目标蛋白。根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例或者所需的各目标蛋白载体的体积以及体积比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)建立标准曲线；/n建立各标准蛋白浓度与各自发光值关系的标准曲线；/n(2)分别构建包含各目标蛋白基因的独立载体，以用于分别表达各目标蛋白；/n(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比的定量关系式；/n将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例加入到一种体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比与所述相应载体的浓度百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致；/n(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度及浓度比例；/n根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度及浓度比例；/n(5)定量共表达多种目标蛋白；/n根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。/n...

【技术特征摘要】
20190530 CN 20191046098781.体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立标准曲线；
建立各标准蛋白浓度与各自发光值关系的标准曲线；
(2)分别构建包含各目标蛋白基因的独立载体，以用于分别表达各目标蛋白；
(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比的定量关系式；
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例加入到一种体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比与所述相应载体的浓度百分比之间的定量关系式；在所述体外无细胞蛋白合成体系中，载体总浓度保持一致；
(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度及浓度比例；
根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，计算出拟表达的所述多种目标蛋白各自所需的载体浓度及浓度比例；
(5)定量共表达多种目标蛋白；
根据步骤(4)得出的所需的各目标蛋白载体的浓度或浓度比例，向步骤(3)所述体外无细胞蛋白合成体系中加入相应量的各目标蛋白的独立载体，经过步骤(3)所述指定的反应时间，获得共表达的所述多种目标蛋白。


2.如权利要求1所述体外定量共表达多种蛋白的方法，其特征在于，所述各目标蛋白的独立载体在各母液中的浓度均相同；
(3)建立各目标蛋白的浓度百分比与相应载体的浓度百分比或者体积百分比的定量关系式；
将步骤(2)所述包含各目标蛋白基因的独立载体，按不同浓度比例或者体积比例加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应；经过一段指定的反应时间后，获取反应液中各目标蛋白的发光值；根据步骤(1)中所述标准曲线计算出各目标蛋白产物的浓度，从而拟合得到各目标蛋白产物的浓度百分比或者体积百分比与所述相应载体的浓度百分比或者体积百分比之间的定量关系式；
在所述体外无细胞蛋白合成体系中，所述载体总浓度保持一致；
(4)计算定量共表达多种目标蛋白所需的载体浓度或者载体体积，以及相应的浓度比例或者体积比例；
根据拟表达的多种目标蛋白的目标浓度比例关系，通过步骤(3)中建立的所述定量关系式，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，李海洋，宋娅凯，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31