表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用。所述疫苗包含猪星状病毒Cap蛋白的C‑端高变区，利用酿酒酵母转录元件高效构建方法将GPD启动子、Cap蛋白C‑端高变区、凝集素Aga1以及纯化标签等串联构建转录单位。本发明专利技术所述的疫苗可由葡萄糖诱导产生，生产成本较低，且适合大规模生产。实验表明，本发明专利技术所述的酿酒酵母菌株具备使用的安全性，且能够诱导显著的黏膜免疫反应和体液免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用
本专利技术属于生物基因工程
，涉及一种表面展示型酵母宿主细胞及制备猪星状病毒酵母疫苗的方法。
技术介绍
酵母表面展示技术(Yeastsurfacedisplay，YSD)是指外源蛋白或肽通过与细胞壁蛋白融合展示在酵母细胞表面的技术。1993年，Schreuder等人[1]首次对酿酒酵母细胞表面展示异源蛋白进行了描述。YSD最初用于生产生物催化剂，随着分子生物学和酵母遗传学的不断发展，YSD已在各个领域得到广泛应用。例如：生物吸附，生物修复和生物传感器的设计。在生物医学领域，例如抗体和口服疫苗的制备。在基础科研领域，YSD被用于分析蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体间的相互作用。α-凝集素系统是YSD中的一种由两部分组成：Aga1亚基(锚定成分)，通过GPI插入细胞壁中；Aga2亚基(粘附成分)，用作靶肽或蛋白质的锚定蛋白。Aga2的Cys7和Cys50残基通过两个二硫键与Aga1结合。生物递送系统作为向黏膜表面递送疫苗的最有效方式之一，目前用于生产疫苗抗原的递送载体主要有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Aga1-Aga2酿酒酵母表面展示系统，其特征在于，包含来源酵母菌株EBY100的Agal基因以及来源PYD1质粒的Aga2基因，所述Agal基因表达Agal亚基作为锚定成分，通过糖基磷脂酰肌醇插入细胞壁中，所述Aga2基因表达Aga2亚基作为粘附成分，用作靶肽或蛋白质的锚定蛋白，通过锚定成分和粘附成分结合，靶肽或蛋白质酿酒酵母表面展示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于Aga1-Aga2酿酒酵母表面展示系统，其特征在于，包含来源酵母菌株EBY100的Agal基因以及来源PYD1质粒的Aga2基因，所述Agal基因表达Agal亚基作为锚定成分，通过糖基磷脂酰肌醇插入细胞壁中，所述Aga2基因表达Aga2亚基作为粘附成分，用作靶肽或蛋白质的锚定蛋白，通过锚定成分和粘附成分结合，靶肽或蛋白质酿酒酵母表面展示。


2.一种载体，其包含权利要求1所述的Aga1片段，其碱基序列为SEQIDNo.15。


3.表面展示型酵母宿主细胞，其特征在于，含有权利要求1中所述的Aga1-Aga2酿酒酵母表面展示系统。


4.一种构建表面展示型酵母宿主细胞的方法，其特征在于，以实验室保存菌株JDY52为出发菌株，PCR克隆GPD启动子，通过反向PCR扩增和无缝连接将PIU211lac启动子替换为GPD启动子，通过醋酸锂转化将线性化质粒PIU211(GPD)转入JDY52，利用SD-URA选择性培养基和基因组PCR筛选阳性转化子，获得组成型葡萄糖启动子GPD调控的、表面高效展示Aga1酵母宿主菌株ST1814G。


5.权利要求4所述的构建表面展示型酵母宿主细胞的方法，其特征在于，具体包括如下步骤；
(1)PIU211重组质粒构建：提取EBY100酵母基因组，PCR扩增Aga1基因，通过无缝克隆将Aga1基因插入到整合型载体YIplac211；
(2)PIU211(GPD)重组质粒构建：遵循无缝克隆技术原理，设计一对反向扩增引物扩增PIU211(除lac启动子外的其余部分)，然后以实验室保存的HCKAN-GPD质粒为模板扩增GPD启动子，在GPD正/反向扩增引物5'末端引入载体的末端序列。通过无缝克隆将PIU211质粒上lac启动子替换为GPD启动子；
(3)线性化载体的制备：重组质粒PIU211(GPD)的外源插入基因Aga1序列中含有限制性内切酶BsiWI的识别位点，用BsiWI消化PIU211或PIU211(GPD)可以获取线性化DNA片段；
(4)表面高效展示Aga1酿酒酵母宿主菌的构建：通过常规醋酸锂转化法将线性化PIU211或PIU211(GPD)片段转入出发菌株JDY52中，通过SD-URA营养缺陷筛选和PCR鉴定，获得表面高效展...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，李婉情，张文涛，赵成雪，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12