【技术实现步骤摘要】
一种大尺度DNA的体内多轮迭代组装方法
本专利技术属于基因组组装技术，具体涉及一种大尺度DNA体内多轮迭代组装方法，尤其是一种CRISPR技术和酵母细胞生活史驱动的大尺度DNA体内多轮迭代组装方法。
技术介绍
DNA的组装是分子克隆，即核酸片段的在生物体内进行的增殖中不可或缺的步骤。它将目标核酸序列引入微生物体的载体中，通常充当载体的是细菌的质粒。DNA克隆和组装技术是现代分子生物学的一项重要工具。近年来，随着结构组学和蛋白组学的发展，特别是旨在应用工程学的研究思路及手段去设计改造基因、生物元件、生物途径，甚至整个基因组的合成生物学的迅速发展，组装DNA元件就显的越来越重要。虽然传统的利用II型限制性内切酶产生合适的DNA片段的酶切连接克隆策略仍然在发挥着重要作用，但是由于酶切位点有限，这种方法在平行无缝克隆或多DNA片段组装方面已显现出其不足之处。随着“人类基因组编写计划”(GP-Write)的开启，科学家们开始尝试合成哺乳动物的基因组，由于哺乳动物的基因组尺度之大，远远超过了细菌和真菌的基因组。因此目前针对细菌和...
【技术保护点】
1.一种大尺度DNA的体内迭代组装的方法，包括如下步骤：/nA、分别在两个交配型不同的酵母细胞中利用接收载体和供体载体引入待组装的片段；/nB、将引入待组装的两个片段的两个交配型不同的酵母菌株进行交配融合，在二倍体酿酒酵母菌株中完成大尺度DNA的组装；/nC、将组装好的二倍体菌株拆孢，得到单倍体菌株供下一轮组装。/n
【技术特征摘要】
1.一种大尺度DNA的体内迭代组装的方法，包括如下步骤：
A、分别在两个交配型不同的酵母细胞中利用接收载体和供体载体引入待组装的片段；
B、将引入待组装的两个片段的两个交配型不同的酵母菌株进行交配融合，在二倍体酿酒酵母菌株中完成大尺度DNA的组装；
C、将组装好的二倍体菌株拆孢，得到单倍体菌株供下一轮组装。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤A具体包括：
步骤1：构建接收载体、供体载体，并分别在MATa型和MATα型两个交配型不同的酵母细胞中整合Cas9基因；
步骤2：在一个交配型酵母细胞中通过供体载体利用原生质体转化组装待组装的片段并引入Leu标签，在另一个交配型酵母细胞中通过接收载体利用原生质体转化组装待组装的片段并引入Ura标签。
3.根据权利要求2所述的方法，步骤1所述接收载体的构建方法为以酿酒酵母BY4741基因组为模板用引物1和引物2扩增同源臂，用BamH1酶切BYM0023载体，同源臂和载体利用Gibson组装构建；引物1的序列如SEQIDNO.1所示，引物2的序列如SEQIDNO.2所示。
4.根据权利要求2所述的方法，步骤1所述供体载体的构建方法为以酿酒酵母BY4741基因组为模板用引物3和引物4扩增同源臂，同时在H3片段两端引入sgRNAVA1的识别位点，用BamH1酶切PCC1-His载体，同源臂和载体利用Gibson组装构建；引物3...
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