DNA大片段的克隆方法技术

本申请提供了一种高效，快速，简易地克隆目的基因片段的方法，尤其是克隆和编辑长度大于100kb，优选大于300kb的DNA大片段的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、扩增、酶切和转化等过程。

Cloning of large DNA fragments

【技术实现步骤摘要】
DNA大片段的克隆方法专利
本申请涉及基因工程
具体地，涉及克隆目的基因片段的方法，本申请的方法尤其适合克隆和编辑长度大于100kb，尤其300kb以上的DNA大片段。专利技术背景对真核和原核生物进行大规模的基因改造依赖大片段基因组DNA克隆技术。但是，目前尚缺少一种高效的克隆超大基因组DNA(一般大于100kb以上，尤其300kb以上)，尤其是真核基因组的方法。本专利介绍了一种高效的克隆和编辑超大基因片段，尤其是真核基因组片段的方法组合技术。传统的基因文库法可以用于克隆一定长度的基因组DNA，例如细菌人工染色体文库最多只可以克隆300kb的外源DNA，酵母人工染色体(YAC)文库，可以克隆200kb到1000kb的基因(Dausset,Ougenetal.1992)。但是基因组文库的构建和阳性克隆的筛选需要大量的工作。另外，现有YAC文库不稳定，长期保存会发生嵌合体和基因丢失(ScottandVos2001)。另一种方法是利用酵母转化相关重组克隆(TAR)技术选择性地从复杂和简单的基因组中克隆染色体大片段。但是，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.克隆目的基因片段的方法，其包括以下步骤：/n1)从染色体或载体(优选BAC载体)获得目的基因片段；/n2)在微生物细胞内将目的基因片段重组到另外的载体中；/n3)使所述另外的载体在微生物中扩增；/n4)用限制性内切酶消化所述另外的载体，以获得DNA片段；/n5)将步骤4)获得的多个有同源末端的DNA片段和线性化的载体一起转化到有同源重组活性的微生物中，优选为酵母，从而在细胞内组装成获得包含多个目的基因片段的按照一定顺序排列的重组子。/n

【技术特征摘要】
1.克隆目的基因片段的方法，其包括以下步骤：
1)从染色体或载体(优选BAC载体)获得目的基因片段；
2)在微生物细胞内将目的基因片段重组到另外的载体中；
3)使所述另外的载体在微生物中扩增；
4)用限制性内切酶消化所述另外的载体，以获得DNA片段；
5)将步骤4)获得的多个有同源末端的DNA片段和线性化的载体一起转化到有同源重组活性的微生物中，优选为酵母，从而在细胞内组装成获得包含多个目的基因片段的按照一定顺序排列的重组子。


2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤1)包括利用基因组编辑技术对所述染色体或载体进行切割以获得所述目的基因片段。


3.根据权利要求1或2的方法，其中所述步骤2)包括利用同源重组拼接技术将所述目的基因片段克隆到所述另外的载体，优选穿梭载体中。


4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤4)中获得的DNA片段为约100kb至300kb的DNA片段，并且所述DNA片段具有同源末端，优选60--800bp,更优选90-200bp的同源末端。


5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述线性化载体为拥有目的DNA片段同源末端序列的线性化载体，优选为线性化酵母穿梭载体。


6.根据权利要求2-5中任一项的方法，其中所述基因组编辑技术选自以下的一种或者多种：锌指核酸酶技术(zincfingernucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶技术(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR)技术，包括CRISPR/Cas9和CRISPR-Cpf1，优选CRISPR/Cas9。


7.根据权利要求3-6中任一项的方法，其中所述同源重组拼接技术选自以下的一种或者多种：序列依赖的体外装配技术(如Gibsonassembling,SLIC，LIC等)，酵母的转化耦联重组(TAR)技术和细菌的Red/ET同源重组技术，优选酵母的转化耦联重组(TAR)技术。


8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述另外的载体选自以下的一种或者多种：BAC(bacterialartificialchromosome)、YAC(Yeastartificialchromosomes)和PAC(P1artificialchromoso...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄菁，杨波，卢娜，
申请(专利权)人：黄菁，
类型：发明
国别省市：北京;11