DNA大片段的克隆方法技术

本申请提供了一种高效，快速，简易地克隆目的基因片段的方法，尤其是克隆和编辑长度大于100kb，优选大于300kb的DNA大片段的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、扩增、酶切和转化等过程。

Cloning of large DNA fragments

【技术实现步骤摘要】
DNA大片段的克隆方法专利
本申请涉及基因工程
具体地，涉及克隆目的基因片段的方法，本申请的方法尤其适合克隆和编辑长度大于100kb，尤其300kb以上的DNA大片段。专利技术背景对真核和原核生物进行大规模的基因改造依赖大片段基因组DNA克隆技术。但是，目前尚缺少一种高效的克隆超大基因组DNA(一般大于100kb以上，尤其300kb以上)，尤其是真核基因组的方法。本专利介绍了一种高效的克隆和编辑超大基因片段，尤其是真核基因组片段的方法组合技术。传统的基因文库法可以用于克隆一定长度的基因组DNA，例如细菌人工染色体文库最多只可以克隆300kb的外源DNA，酵母人工染色体(YAC)文库，可以克隆200kb到1000kb的基因(Dausset,Ougenetal.1992)。但是基因组文库的构建和阳性克隆的筛选需要大量的工作。另外，现有YAC文库不稳定，长期保存会发生嵌合体和基因丢失(ScottandVos2001)。另一种方法是利用酵母转化相关重组克隆(TAR)技术选择性地从复杂和简单的基因组中克隆染色体大片段。但是，在现有技术中，TAR克隆技术较多地被用于克隆300kb以内的DNA(KouprinaandLarionov2006)而很难用于来克隆超过300kb的基因。原因在于，300kb以上的基因只能从基因组DNA分离(BAC载体一般小于300kb)，随着被克隆基因变大，基因操作时DNA容易断裂，完整DNA浓度低，重组效率低。同时，这种方法依赖限制性内切酶分离DNA。当需要分离较大的DNA片段时，很难找到特异的内切酶完整的分割所需的DNA大片段。另外，在克隆较大的DNA片段时，TAR重组位点和DNA酶切位点较远也导致重组效率非常低，只有约2％。且这种重组效率随着DNA片段长度的增加而极度变低。近年来发展的基因编辑技术(ZFNs(engineeredzinc-fingernucleases),TALENs(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)andCRISPR-Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsthatarerecognizedbyCas9nuclease)克服了上述缺点，有利于大片段基因的克隆。例如CRISPR/cas9系统，引导RNA(gRNA)可以特异性的识别20个核酸序列长度的DNA，而gRNA可以招募Cas9，在识别位点进行切割。跟限制性内切酶比，该技术可以具有极强的位点识别特异性。现有CRISPR/cas9技术和DNA序列依赖的拼接技术(Ligationindependentcloning,LIC；Sequenceandligation-independentcloning，SLIC；Gibsonassembling)联合，可将外源DNA重组到细菌人工染色体(BAC)(Jiang,Zhaoetal.2015；Wang,Wangetal.2015)。然而，CRISPR和Gibsonassembling技术联合的体外重组技术只能有效克隆100kb以下的DNA片段。基因编辑技术还可以和细菌的Red/ET重组技术相结合用于克隆大片段的DNA。如，将被CRISPR切割的DNA片段也可和线性载体一起转化到表达λ噬菌体Red/ET重组系统的细菌中DNA片段可以在细菌体内通过序列依赖的酶促反应拼装成单一的重组子(Baker,Guptaetal.2016)。但是由于BAC载体装载能力和线性大片段DNA转化到细菌的限制，理论上也很难获得200kb以上的单个重组子。酵母转化相关的重组(TAR)技术可以在酵母细胞内克隆20kb到250kb的外源DNA(KouprinaandLarionov2006)。CRISPR/cas9技术和TAR克隆技术联合使用可以提高TAR克隆的效率但不能显著提高克隆大片段DNA的克隆长度(Lee,Larionovetal.2015)。并且由于YAC载体在酵母的拷贝数低，很难分离纯化以获得足量的DNA用于下一步克隆和基因编辑。在真核生物中，有些基因座或基因家族(如TCR、HLA、抗体基因、P450基因家族等)的长度要远大于300kb。目前尚无针对这些超大基因的克隆方法。考虑到上述一步克隆方法不能得到超大基因片段的克隆，利用某些细胞特有的同源重组修复机制，有可能将多个基因片段在细胞内装配成超大片段的重组子。例如在表达lambdaRed/ET重组酶的细菌可以实现细胞内多片段DNA的装配。但是，大多数真核基因富含重复序列，或GC富集区。由于细菌内重组酶活性，这些大片段基因序列容易在细菌内不稳定，易发生重组。另外，细菌对于大片段DNA的转化能力低，也影响了这些大片段基因在细胞内的重组。有报道，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)可在细胞内装配大片段DNA(Itaya,Tsugeetal.2005；Yonemura,Nakadaetal.2007)。但是枯草芽孢杆菌的培养不稳定，DNA转化能力低。也不适合多片段大基因的重组。现有技术中报道了，将DNA化学合成法，聚合酶链式反应(PCR)法，细胞外GibsonDNA装配法和酵母细胞同源重组依赖的多片段装配法联用，可将超过100万个碱基对的细菌基因克隆在YAC载体里(Gibson,Glassetal.2010)。但是，这种方法的缺陷在于DNA序列几乎是从头开始合成，操作步骤多，周期长，保真性差容，技术繁杂，成功率低。例如该方法需要很多步骤(基因合成，PCR，体外连接等方法联合使用)才能得到100kb的基因。而10个以上的100kbDNA片段才可以在酵母细胞内装配成超过1000kb的基因。另外，真核生物的基因组DNA含有大量的简单重复序列。常规基因合成和PCR等方法很难对这些含有大量重复序列的真核生物DNA进行克隆。而这些DNA序列对基因表达的调节、基因组稳定性等具有重要的影响。因此从头合成大核酸装配法不仅技术繁琐步骤多而且还不利于含有简单重复序列的真核基因的克隆。综上，现有技术中尚缺少高效的，针对大片段基因组DNA，针对100kb以上，尤其300kb以上含有复杂序列真核基因克隆的方法。此外，有文献报道，复制起始序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)缺失的YAC载体可以有效地在酵母细胞中克隆含有类ARS序列的基因组DNA(Noskov,Koriabineetal.2001)。但是这种方法对目的基因有选择性。因此，需要建立新的YAC载体用于在酵母中克隆任何非选择性的大片段DNA。专利技术概述为了解决现有技术中存在的缺少针对大片段基因组DNA，特别是含有复杂序列的真核基因克隆的方法的问题，我们进行了深入的研究。本申请首次提供了高效，快速，简易地克隆100kb以上，尤其300kb以上的DNA片段的方法。具体来说，在本申请中，我们利用基因组编辑技术，例如Crispr/Cas9技术，TAR克隆技术和酵母DNA同源序列依赖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.克隆目的基因片段的方法，其包括以下步骤：/n1)从染色体或载体(优选BAC载体)获得目的基因片段；/n2)在微生物细胞内将目的基因片段重组到另外的载体中；/n3)使所述另外的载体在微生物中扩增；/n4)用限制性内切酶消化所述另外的载体，以获得DNA片段；/n5)将步骤4)获得的多个有同源末端的DNA片段和线性化的载体一起转化到有同源重组活性的微生物中，优选为酵母，从而在细胞内组装成获得包含多个目的基因片段的按照一定顺序排列的重组子。/n

【技术特征摘要】
1.克隆目的基因片段的方法，其包括以下步骤：
1)从染色体或载体(优选BAC载体)获得目的基因片段；
2)在微生物细胞内将目的基因片段重组到另外的载体中；
3)使所述另外的载体在微生物中扩增；
4)用限制性内切酶消化所述另外的载体，以获得DNA片段；
5)将步骤4)获得的多个有同源末端的DNA片段和线性化的载体一起转化到有同源重组活性的微生物中，优选为酵母，从而在细胞内组装成获得包含多个目的基因片段的按照一定顺序排列的重组子。


2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤1)包括利用基因组编辑技术对所述染色体或载体进行切割以获得所述目的基因片段。


3.根据权利要求1或2的方法，其中所述步骤2)包括利用同源重组拼接技术将所述目的基因片段克隆到所述另外的载体，优选穿梭载体中。


4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤4)中获得的DNA片段为约100kb至300kb的DNA片段，并且所述DNA片段具有同源末端，优选60--800bp,更优选90-200bp的同源末端。


5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述线性化载体为拥有目的DNA片段同源末端序列的线性化载体，优选为线性化酵母穿梭载体。


6.根据权利要求2-5中任一项的方法，其中所述基因组编辑技术选自以下的一种或者多种：锌指核酸酶技术(zincfingernucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶技术(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR)技术，包括CRISPR/Cas9和CRISPR-Cpf1，优选CRISPR/Cas9。


7.根据权利要求3-6中任一项的方法，其中所述同源重组拼接技术选自以下的一种或者多种：序列依赖的体外装配技术(如Gibsonassembling,SLIC，LIC等)，酵母的转化耦联重组(TAR)技术和细菌的Red/ET同源重组技术，优选酵母的转化耦联重组(TAR)技术。


8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述另外的载体选自以下的一种或者多种：BAC(bacterialartificialchromosome)、YAC(Yeastartificialchromosomes)和PAC(P1artificialchromoso...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄菁，杨波，卢娜，
申请(专利权)人：黄菁，
类型：发明
国别省市：北京;11