一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法技术

本发明专利技术提供了一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法，具体地，通过在编码eIF4E结合蛋白的核苷酸序列前插入强启动子序列构建的多核苷酸序列或载体，实现对Eap1p、p20等eIF4E结合蛋白过表达，并利用含有该改造的细胞裂解液进行外源蛋白合成。本发明专利技术提供了提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系，本发明专利技术的合成体系可显著提高蛋白质翻译的效率。

A protein synthesis system for increasing the expression of foreign proteins and its application

【技术实现步骤摘要】
一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法
本专利技术涉及生物工程
，具体地，涉及一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法。
技术介绍
蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白的序列和结构不同，决定了其功能的不同。在细胞内，蛋白可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动。在细胞中，蛋白质翻译的调节在应对营养缺失等外界压力，细胞发育与分化等很多过程中发挥重要作用。蛋白质翻译的四个过程包括翻译起始、翻译延伸、翻译终止和核糖体再循环，其中受调控最多和限速的步骤是翻译的起始[1]。真核细胞的翻译起始可以分为两大类：“帽子结构”依赖的传统途径和“帽子结构”非依赖的途径。在细菌的翻译起始过程中，30S小亚基在3种起始因子的介导下直接在起始密码子的AUG附近形成起始复合体。真核生物的翻译起始则较为复杂，需要11种起始因子，并且核糖体在起始蛋白质合成时与mRNA结合的位点与原核生物不同[2]。真核生物的具有“帽子结构”(capstructure,m7GpppN)的mRNA翻译起始主要是通过依赖“帽子结构”的扫描机制进行的[1-3]。直接与帽子发生相互作用的是eIF4F，由eIF4G蛋白同时结合RNA解旋酶eIF4A和eIF4E而组成的翻译因子起始复合物。其中的eIF4E是帽子结合蛋白，为真核生物蛋白质合成途径中的关键调控靶点。在哺乳动物细胞中，与eIF4E发生相互作用的蛋白4E-BPs(eIF4E-bindingproteins)，通过结合eIF4E，使其不能和eIF4G结合，从而不能形成翻译起始复合物eIF4F，抑制依赖帽子结构的mRNA的翻译[4]。人源4E-BP1蛋白是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)的底物之一，磷酸化水平受到mTOR信号通路的调控。当Thr37，Thr46和Ser65，Thr70残基被mTORC1先后磷酸化以后，4E-BP1将从eIF4E上解离，从而促进eIF4F起始复合物的形成和依赖帽子结构的翻译起始[5-6]。mTOR信号通路影响真核细胞中翻译起始及蛋白质合成，在细胞生长增殖过程中起重要作用。mTOR是一类与细胞增殖紧密相关的丝/苏氨酸蛋白激酶,在进化上十分保守，从酵母到哺乳动物广泛存在，对细胞外包括生长因子，胰岛素，营养素，氨基酸，葡萄糖等多种刺激产生应答[7]。人类的编码TOR蛋白的基因和酵母中的同源性高达40％-60％[8]。在酵母体内没有和哺乳动物4E-BPs在结构上类似的蛋白，在功能上具有类似的结合eIF4E的蛋白有p20和EAP1p。这两种蛋白有一段高度相似的13个残基序列，其中包含了eIF4E的结合域YxxxxLΦ,x为任意氨基酸残基，Φ为疏水残基。除了这一段序列，这两种蛋白没有其他相似的地方，可能EAP1p还具有其他的功能会进一步影响TOR信号通路的下游[9]。对于其他真核生物的eIF4E结合蛋白，人源的4E-BP1、4E-BP2、鼠源的PHAS-I的蛋白序列都已有文献报道[10]。制备的酵母裂解液中含有大量的蛋白质合成翻译机器，可以通过外源添加模板而合成目标蛋白。但是酵母原来的mRNA也会继续使用资源合成非目标杂蛋白，影响目标蛋白的合成效率和产量。本专利技术通过过表达Eap1p，与eIF4G竞争性结合eIF4E,减少翻译起始复合物eIF4F的形成，在体外抑制酵母裂解液中原来的mRNA帽子依赖的翻译过程，使更多的资源(如其他翻译因子，核糖体和氨基酸等)用于合成外源添加的不依赖帽子结构的体外蛋白合成体系模板，从而显著提高体外合成蛋白质的效率和产量。然而，本领域目前的体外生物合成系统的蛋白翻译合成的效率还较低，难以令人满意，因此，本领域亟需开发一种新的可提高外源蛋白翻译合成效率的体系和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的可提高外源蛋白翻译合成效率的合成体系和方法。同时，还提供经过改造的基因工程菌株及其应用，如基因工程菌株的细胞裂解液(细胞提取物)及其在无细胞蛋白合成中的应用。本专利技术第一方面提供了一种用于体外无细胞蛋白合成的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的基因组中整合有表达第一核酸构建物的第一外源基因表达盒，所述第一核酸构建物具有从5’至3’的式I结构：A1-A2(I)；式中，A1、A2分别为用于构成所述构建物的元件；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；A1为启动子元件；A2为eIF4E结合蛋白的编码序列；并且，在所述基因工程菌株中，eIF4E结合蛋白的表达或活性显著增强。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白选自下组：EAP1p、p20、eIF4G1、eIF4G2、4E-BP1、4E-BP2、PHAS-I之一或其组合。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白来源于酵母。在另一优选例中，所述酵母选自下组：酿酒酵母、克鲁维酵母属酵母、或其组合。在另一优选例中，所述克鲁维酵母属酵母选自下组：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母(Kluyveromycesdobzhanskii)、或其组合。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白选自下组：EAP1p、p20、之一或其组合。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白来源于人或鼠。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白选自下组：4E-BP1、4E-BP2、PHAS-I、之一或其组合。在另一优选例中，所述启动子元件选自下组：GAPDH1、HXK1、PGK1、TEF1、TIF1、ADH1、SED1之一或其组合。在另一优选例中，所述启动子元件选自下组：pScGAPDH1、pKlHXK1、pKlPGK1、pScPGK1、pScSED1、pScADH1、pKlGAPDH1之一或其组合。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白的表达或活性显著增强指eIF4E结合蛋白的表达或活性提高了≥30％，更佳的，≥50％，更佳地，≥70％，更佳地，≥90％。在另一优选例中，所述eIF4E结合蛋白的表达或活性显著增强指与野生型菌株相比，所述工程菌株中的eIF4E结合蛋白的表达或活性(E1)/野生型菌株中的管家蛋白或参考蛋白的表达或活性(E2)≥1，较佳地，≥2，更佳地，≥3。在另一优选例中，所述菌株中的eIF4E结合蛋白的表达或活性的显著增强通过选自下组的方式实现：Crispr技术。在另一优选例中，所述元件A2包括野生型和突变型的eIF4E结合蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述元件A2具有SEQIDNO.:1所示的序列或其活性片段，或者具有与SEQIDNO:1所示核苷酸序列≥85％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)且具有与SEQIDNO.:1序列相同活性的核苷酸。在另一优选例中，所述的eIF4E结合蛋白为来自本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高外源蛋白的表达量的体外蛋白合成体系，所述合成体系至少包括细胞裂解产物，所述细胞裂解产物来自于基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因序列中整合有在编码eIF4E结合蛋白的核苷酸序列前插入强启动子序列构建的多核苷酸序列；且该合成体系中不添加或额外添加eIF4E结合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高外源蛋白的表达量的体外蛋白合成体系，所述合成体系至少包括细胞裂解产物，所述细胞裂解产物来自于基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因序列中整合有在编码eIF4E结合蛋白的核苷酸序列前插入强启动子序列构建的多核苷酸序列；且该合成体系中不添加或额外添加eIF4E结合蛋白。


2.根据权利要求1所述的合成体系，其特征在于：所述强启动子序列选自GAPDH1、HXK1、PGK1、TEF1、TIF1、ADH1、SED1之一或其组合。


3.根据权利要求2所述的合成体系，其特征在于：所述强启动子序列选自pScGAPDH1、pKlHXK1、pKlPGK1、pScPGK1、pScSED1、pScADH1、pKlGAPDH1之一或其组合。


4.根据权利要求1-3的任意一项所述的合成体系，其特征在于：所述的eIF4E结合蛋白为Eap1p、p20、4E-BP1、4E-BP2、PHAS-I的一种或其组合。


5.根据权利要求1-3的任意...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，丁晓辉，刘显成，杨宁，王绍杰，董颖颖，王静，代田纯，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31