The invention belongs to the field of plant gene engineering technology, in particular to a method and application for improving the regeneration and transformation efficiency of cotton. Through the comparison of regeneration ability of cotton obtained good agronomic traits of transgenic receptor material Y668, with Y668 as the training materials of GFP transgenic receptor receptor isolated groups of T1 generation plant Null negative for the organization, after two consecutive times of regeneration for R2 group, the selection, through the typical plant regeneration ratio were obtained the parents raise recipient material 3 times 668 Jin. The present invention also discloses the application of Jin in transgenic cotton in 668. With the Jin668 prepared by the invention as a transgenic receptor material, a plurality of insect resistant and oil enhancing genes are introduced into cotton host cells, and transgenic cotton plants expressing foreign genes are obtained.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
,具体涉及一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。
技术介绍
一个成功的棉花的遗传转化体系依赖于高效稳定的转化和植株再生过程。随着农杆菌介导的遗传转化和基因枪转化的广泛应用,棉花的转化技术日益成熟,转基因抗虫棉也取得了巨大的成功,但是转化细胞的再生的频率和受体棉花基因型的限制仍是棉花转基因的最重要限制因素。前期研究表明棉花组织培养植株再生的途径主要是通过两种途径:一是器官发生途径,二是体细胞胚胎发生途径。目前,体细胞胚胎发生是棉花植株再生的主要途径。棉花野生种克劳茨基棉最早实现了胚胎发生,但当时没有能得到再生植株。1983年Davidonis等在继代了两年的陆地棉珂字310的胚性愈伤组织中得到了再生植株。其它研究者也报道了成功的棉花体细胞胚胎发生和植株再生。Trolinderetal(1987)通过硝酸钾加倍和悬浮培养等改进技术,得到了一个简单高效的再生程序。但这种方法比较适用于珂字棉系列,而且再生的植株会有一定程度上的细胞学和形态学的变异。陈志贤等(1987)等将Trolinder的技术引入中国,成功的再生了多个国内品种。张家明和孙济中(1994),张家明和张献等(1997)研究发现具有胚胎发生能力的品种具有较为明显的地域性特征,黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。Sunetal(2006)成功再生了多个野生棉材料,并从珂字201的六种外植体分离的原生质体通过体细胞胚胎发生得到了再生植株(Sunetal.,2005)。早期研究表明影响体细胞胚发生和植株再生的因素的主要因素如下:包括外植体类型,激素组合,基因型, ...
【技术保护点】
一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法,其特征在于,包括下列步骤:A、在愈伤组织诱导阶段,利用含有IBA+KT和2,4‑D+KT两种不同的激素组合的愈伤诱导培养基对棉花植株的再生能力进行评估,测定愈伤诱导效率、愈伤增殖速度、愈伤质量以及愈伤分化时间和效率,得到再生能力超过棉花组织培养模式材料珂字棉棉310、棉312和泗棉3号的优良基因型Y668,将所得的棉花品种Y668作后续驯化试验;B、利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花品种Y668,获得T0转基因后代,使T0转基因植株自交获得T1代分离群体,选择T1群体中的阴性单株作为下一步驯化对象;C、对R0代阴性分离单株进行连续两次的再生试验,依次获得R1,R2群体,在R1,R2世代中,以棉花品种Y668为对照,剔除农艺性状有变异的株系,在驯化的R1,R2群体中保留原始品种的典型农艺性状,通过R2群体自交得到保藏编号为CCTCC NO:P201519的转基因受体材料Jin668。
【技术特征摘要】
1.一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法,其特征在于,包括下列步骤:A、在愈伤组织诱导阶段,利用含有IBA+KT和2,4-D+KT两种不同的激素组合的愈伤诱导培养基对棉花植株的再生能力进行评估,测定愈伤诱导效率、愈伤增殖速度、愈伤质量以及愈伤分化时间和效率,得到再生能力超过棉花组织培养模式材料珂字棉棉310、棉312和泗棉3号的优良基因型Y668,将所得的棉花品种Y668作后续驯化试验;B、利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花品种Y668,获得T0转基因后代,使T0转基因植株自交获得T1代分离群体,选择T1群体中的阴性单株作为下一步驯化对象;C、对R0代阴性分离单株进行连续两次的再生试验,依次获得R1,R2群体,在R1,R2世代中,以棉花品种Y668为对照,剔除农艺性状有变异的株系,在驯化的R1,R2群体中保留原始品种的典型农艺性状,通过R2群体自交得到保藏编号为CCTCCNO:P201519的转基因受体材料Jin668。2.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法,其特征在于,步骤B中所述的农杆菌介导的遗传转化方法是指以绿色荧光蛋白GFP为报告基因,通过农杆菌介导的遗传转化方法,获得转基因植株T0,具体步骤如下:(1)选择饱满、健康的Y668棉花种子剥去种皮后,用0.1%的HgCl2浸泡10min,再用无菌水洗涤3次,将灭菌后的Y668棉花种子接种于无菌苗萌发培养基上,在28℃黑暗条件下于恒温箱中培养4-6d后,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段,接种于0.5OD的用农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中,侵染10mim后,用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液,将下胚轴接种在共培培养基的培养皿中,在21℃,黑暗条件下共培养2天,最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中,冲洗3遍,吸干表面水份后,接种到选择培养基中,每1个月继代1次;(2)将步骤(1)所得的愈伤组织转到分化培养基中,至产生体细胞胚及幼苗;(3)将步骤(2)所得的体细胞胚及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中,直至获得再生植株;(4)将步骤(3)所得的再生植株进行水培、驯化处理,然后移栽到温室土钵中;(5)将步骤(4)获得的再生植株进行PCR和荧光检测鉴定,筛选获得阳性单株,通过使阳性植株自交获得分离群体,再通过荧光检测和PCR方法,鉴定出T1群体的中阴性分离单株,使其自交后获得R0群体;其中:用于鉴定阳性植株的PCR的引物序列如下:GFP-正向引物:GTTCTCTGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG,GFP-反向引物:GATCTTCTCTTGGACAGCTCGTCCATGCCG;PCR反应程序:94℃预变性2min;94℃变性1min...
【专利技术属性】
技术研发人员:金双侠,涂礼莉,张献龙,
申请(专利权)人:华中农业大学,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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