表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，其是将携带有经过密码子优化的羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的表达载体转入BCG中构建得到的。由布氏菌产生的胞质结合蛋白PBP39(编码基因为P39)和布氏菌核糖体蛋白L7/L12均为T细胞抗原。卡介苗BCG是迄今唯一商品化的预防结核的疫苗，它不仅具有显著的免疫佐剂效应，而且是一种性能良好、安全性高的外源基因表达宿主。利用BCG表达经过密码子优化的布氏菌P39和L7/L12融合基因既可以提高目的基因的表达量，所得rBCG疫苗又能模拟布氏菌胞内感染与寄生的特性，更有效地诱导机体产生免疫应答，还能发挥BCG作为表达宿主的高安全性、制备简单、成本低廉等优点以及BCG本身所具有的免疫佐剂效应，有望成为新型的布鲁氏菌病疫苗。

【技术实现步骤摘要】
表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法
本专利技术涉及基因工程及疫苗制备
，具体地说，涉及一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布氏菌感染引起的一种人畜共患传染病。布氏菌是一种兼性胞内寄生菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性。该菌属主要包括羊种、牛种、猪种和犬种等6个生物种，中国流行的主要是前3种，其中以羊种布氏菌感染最常见。布病的传播方式为动物—动物和动物—人群。羊、牛、猪等家畜最易感染，动物感染后可导致生殖器官和胎膜发炎、流产、不育和各种组织病变，极大地增加了向人群传播的几率。人群对布氏菌普遍易感，一般羊种布氏菌对人危害最大。人与病畜及受污染的畜产品接触后，布氏菌可通过消化道、呼吸道、泌尿生殖道、皮肤及眼结膜等途径感染。近20年来，我国布病疫情日趋严重并由迅速蔓延的趋势。国内外现行的布病疫苗均为减毒活疫苗，这些疫苗普遍存在毒性较大、保护周期较短、无法区分自然感染和疫苗接种等诸多不足，无法满足布病防控的现实需求。因此，新型布病疫苗的研究与开发对于控制布病疫情的蔓延具有重要意义，也是国内外布病研究的热点。现已证实的布氏菌T细胞抗原包括PBP39、L7/L12和Cu-ZnSOD等，这些蛋白及其编码基因已用于布病亚单位疫苗和DNA疫苗的实验研究。卡介苗(BacillusCalmette-Guérin,BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，在世界卫生组织全球性扩展免疫计划中广泛使用。BCG具有数十年大量安全使用记录、热稳定性好、生产成本低、显著的佐剂效应以及经口服可诱导有效粘膜免疫等特点，同时BCG也是一种极具吸引力的活疫苗载体，利用BCG作为新型疫苗的表达宿主前景诱人。近年来，以BCG为载体的重组BCG疫苗研发日益受到国内外研究学者的关注和重视，针对的病原体涉及细菌、病毒、寄生虫及肿瘤等，具有广阔的发展前景。目前国内外尚未见有关构建携带羊种布氏菌M5株39kDa胞质结合蛋白PBP39编码基因(P39基因)与核糖体蛋白L7/L12编码基因(L7/L12基因)的融合基因(P39-L7/L12基因)重组BCG的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法。本专利技术的另一目的是提供所述rBCG在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种基因表达盒，包含由经过密码子优化的羊种布氏菌P39基因和经过密码子优化的L7/L12基因组成的融合基因。本专利技术中，用于组成羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的P39、L7/L12基因均来自于羊种布鲁氏菌(Brucellamelitensis)M5菌株(CMCC55009)，且经过密码子优化，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供一种表达载体，所述表达载体携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的表达盒。优选地，所述表达载体的出发载体为大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV361。更优选地，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，其是将携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因表达盒的表达载体转入BCG中，筛选获得可分泌表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG。本专利技术表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，由以下方法构建获得：1)根据已公开的羊种布氏菌M5株基因P39和L7/L12的序列，采用Jcat软件进行密码子优化后，人工合成全序列优化后的P39和L7/L12基因，将构建得到的融合基因P39-L7/L12作为目的基因；2)携带有优化后的羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的重组表达载体的构建：将上述目的基因通过PvuⅡ和BstBⅠ两个酶切位点插入穿梭表达载体pMV361；3)宿主菌转化：将步骤2)构建得到的重组表达载体转化至BCG中，筛选阳性克隆，即得可分泌表达羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的rBCG。本专利技术还提供所述rBCG在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。本专利技术还提供由所述rBCG制备的布鲁氏菌病疫苗。可将本专利技术所述的rBCG直接作为布鲁氏菌病疫苗使用，或者辅以免疫佐剂，制成布鲁氏菌病疫苗。本专利技术具有以下优点：(一)由布氏菌产生约39kDa大小的胞质结合蛋白PBP39(编码基因为P39)以及布氏菌核糖体蛋白L7/L12(相对分子量大小约为15kDa，其编码基因为L7/L12基因)均为T细胞抗原，能刺激机体产生有效的免疫应答。(二)BCG(卡介苗)是迄今唯一商品化的预防结核的疫苗，作为外源基因的表达宿主制备的疫苗具有安全性高、热稳定性好、制备简单、价格低廉等优点。(三)BCG本身具有显著的免疫佐剂效应，因此rBCG疫苗无需添加疫苗佐剂，进一步节约了成本。(四)BCG也是一种兼性胞内寄生菌，rBCG可以模拟布氏菌感染和胞内寄生的特征，更有效地诱导机体产生免疫应答。(五)P39-L7/L12融合基因经过密码子优化后，能够提高外源基因在BCG的表达量(经60℃诱导4小时后，表达量可提高50％以上)，解决了因外源基因表达量不高所致的重组BCG免疫效果不佳的难题。(六)动物实验结果表明，构建的rBCG能够诱导小鼠产生明显的免疫应答。(七)利用羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因制备重组BCG疫苗具有重要的研究意义和潜在的应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例2中经优化和未经优化的P39-L7/L12融合基因构建的重组BCG中目的蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1：携带未经优化的P39-L7/L12融合基因重组BCG；2：携带经优化后的P39-L7/L12融合基因重组BCG；3：携带经优化后的P39-L7/L12融合基因重组BCG(温度诱导)；4：未转染的BCG；M：蛋白Marker。图2为本专利技术实施例3中构建的不同重组BCG对Balb/c小鼠的免疫效果比较。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的重组表达载体的构建包括以下步骤：1、根据已公开的羊种布鲁氏菌M5株基因P39和L7/L12的序列(GenBank:EF189139.1；GenBank:EF173477.1)，采用Jcat软件进行密码子优化后，人工合成全序列优化后的P39-L7/L12融合基因作为目的基因。(融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)。2、携带有优化后的M5菌株P39-L7/L12融合基因的重组表达载体的构建：将上述目的基因通过PvuⅡ和BstBⅠ两个酶切位点插入穿梭表达载体pMV361。3、插入正确的重组表达载体的验证。通过核酸序列测定，证实携带有优化后的羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的重组表达载体构建成功。实施例2表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因表达盒，其特征在于，包含由经过密码子优化的羊种布氏菌P39基因和经过密码子优化的L7/L12基因组成的融合基因。

【技术特征摘要】
1.一种基因表达盒，其特征在于，包含由经过密码子优化的羊种布氏菌P39基因和经过密码子优化的L7/L12基因组成的融合基因。2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述P39基因和所述L7/L12基因均来自于羊种布氏菌M5菌株，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带有权利要求1或2所述的基因表达盒。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，出发载体为大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV361。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。6.表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，其特征在于，其是将权利要求3-5任一项所述的表达载体转入BCG中，筛选获得可分泌表达羊种布氏菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：石艳春，郑源强，韩新荣，周玉美，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15