定点整合大片段外源DNA的方法技术

本申请提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA，例如300kb以上大片段外源DNA的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、定点整合和筛选等过程。

【技术实现步骤摘要】
定点整合大片段外源DNA的方法专利
本申请涉及基因工程
具体地，涉及定点整合目的基因片段的方法，本申请的方法适合将目的基因片段，尤其是300kb以上大片段外源DNA高效地定点整合到细胞的基因组中。专利技术背景对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，尤其是对基因组中定点整合超长基因片段，尤其长度在300kb以上的外源基因大片段一直是生物技术的难点问题。哺乳动物人工染色体(mammalianartificialchromosome，MAC)是从哺乳动物细胞中分离出的，并由复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。该载体可以用于装载大于1000kb的外源DNA片段。利用微细胞介导的染色体转移技术(microcellmediatedchromosometransfer，MMCT)可以将MAC所携带的大片段外源基因导入真核细胞(Martella,Pollardetal.2016)。由于MAC是游离于染色体存在的，因此外源基因不能稳定地整合到细胞染色体内，并获得稳定的遗传。酵母人工染色体(Yeastartificialchromosomes，YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，其中可以插入100-2000kb的外源DNA片段。利用酵母原生质体融合(yeastspheroplastcellfusion)技术可以将装配有大片段外源DNA的YAC载体插入到受体细胞染色体中(Mendez,Greenetal.1997)。但是这种办法存在一系列问题：外源基因拷贝数目不可控，基因组整合位置随机，YAC载体调控序列导致受体细胞受到基因污染，在细胞融合和整合过程中大片段基因容易断裂等。同时，利用这种方法建立转基因小鼠时，既需要对基因编辑的ES细胞克隆进行大量的基因型鉴定，也需要对不同的转基因小鼠系的表型进行鉴定。细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)是一种以F质粒(F-plasmid)为基础构建而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb-200kb大小的DNA片段。由于BAC载体具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点，常被用来进行基因改造。利用传统的同源重组技术或重组酶系统可以将100kb到200kb的外源基因定点整合到胞基因组特定位置((Valenzuela,Murphyetal.2003；Wallace,Marques-Krancetal.2007)。受到BAC载体基因容量的限制，如果希望对基因组进行更大规模的修饰，如定点插入或原位替换，则需要对细胞进行复杂的多次基因修饰(Macdonald,Karowetal.2014；Murphy,Macdonaldetal.2014)。这种策略无疑周期长，技术难度高。因此，本领域急需对基因组中定点整合大片段外源DNA，尤其300kb以上大片段外源DNA的方法。专利技术概述对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，特别是将大片段的外源DNA定点整合到基因组中，一直是当前生物技术难点问题。定点整合的主要技术难点包括如下方面：1).难以将大片段的外源DNA克隆到基因载体里；2).难以完整地将含有大片段外源DNA的载体导入真核细胞；3).难以高效地将大片段外源DNA定点整合到受体细胞的基因组中；4).难以高效地筛选并检测定点整合重组细胞克隆。本专利通过一系列技术革新，解决了上述技术难题，首次提供了一种对基因组中高效稳定地定点整合大片段外源DNA，尤其300kb以上大片段外源DNA的方法。具体来说，一方面本申请利用了改良的重组酶系统Cre/Loxp，即利用Loxp71/66突变体将外源DNA稳定地不可逆地定点整合到受体细胞的基因组中。Cre-Lox重组是一种用于在细胞DNA的特定位点上进行删除、插入、转座和倒位操作的位点特异性重组酶技术。Loxp位点由34bp的特殊位点序列组成，其中中间8bpDNA碱基是不对称序列，决定了Loxp序列的方向，不对称序列两边是两段13bp反向对称序列，决定了与Cre的结合效率。虽然常规的Cre-Lox重组方法可催化外源基因的定点整合。但是在最初的实验中，野生型的Loxp不能将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。经分析，这可能是因为Cre催化的Loxp序列依赖的重组反应是可逆的，即Loxp位点之间可能发生反向重组或删除，所以野生型Loxp位点不能有效地介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体。当对称序列的一端发生突变，如Loxp71(5’端对称序列存在突变)和Loxp66(3’端对称序列存在突变),Cre仍然可以催化突变Loxp之间(如Loxp71和Loxp66)发生重组反应。Loxp71和Loxp66发生重组反应后，产生野生型Loxp和双突变Loxp(Loxp71/66)。因为Loxp71/66的两端的对称序列都发生突变，其和Cre的结合能力大为降低，因此避免了野生型Loxp和Loxp71/66之间发生反向重组反应，导致外源DNA稳定地不可逆地整合到细胞染色体里，从而增强了敲入基因的稳定性。本申请首次发现了，这种突变型Loxp，而非野生型Loxp，有助于大片段DNA的定点整合到细胞基因组中。原理如说明书附图中的图2。本申请通过实验发现，对于介导大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，Loxp双突变Loxp66/71是最优选的方案。相对于野生型Loxp，或者含1个突变的Loxp，例如Loxp/Loxp66或者Loxp/Loxp71，或者含其他突变位置的Loxp双突变，loxp66/71的效果最好，转化效率最高，能最有效最稳定地将大分子DNA稳定地定点整合到细胞染色体，最适合于大片段DNA的定点整合和克隆。另外，为了高效地筛选定点整合到染色体上的重组子，本申请还分别在DNA和染色体的Loxp位点之后设计了功能互补且截断型的抗性基因新霉素(NeoR)的表达盒。只有定点位置插入外源基因的重组子才可以表达G418药物的抗性，随机整合的DNA片段则不能产生药物抗性。示意图见说明书附图中的图3。同时，本申请使用了FLP/FRT系统来切除不必要的载体序列和G418抗性表达盒。基因修饰元件及其重组原理见说明书附图中的图3。此外，由于YAC载体最多可以容纳2000kb的外源DNA片段，本申请选用YAC作为装载外源基因的载体。传统的YAC载体是线性结构，在细胞内不稳定，容易发生断裂和同源重组。对此，本申请利用YAC载体将大片段DNA装载到环状的YAC载体中，从而提高了完整基因定点插入细胞染色体的效率。大片段DNA定向敲入受体细胞的难度在于转化效率低，且外源DNA容易断裂，而且大片段DNA从酵母细胞纯化效率很低，因此本申请选用了酵母原生质球融合技术(yeastprotoplastfusion)。将酵母内的大片段外源基因导入到受体细胞。这种方法对外源基因体大小没有限制，而且可以避免外源基因在纯化过程中发生断裂(Brown，Chanetal.2017)。本专利通过以上一系列的技术设计从而克服了大分子DNA定点整合染色体DNA过程中存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：/n1)获得目的基因片段；/n2)将目的基因片段克隆到载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1，所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp 1，优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分；/n3)将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内，优选为酵母，尤其是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞内；/n4)将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2，所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp 2，优选Loxp71序列、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES-PuroR结构；/n5)诱导CreERT2的重组酶活性，优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因，优选新霉素的抗性表达盒；/n6)筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：
1)获得目的基因片段；
2)将目的基因片段克隆到载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了抗性表达盒1，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒1，所述表达盒1在5’至3’方向上包含突变型Loxp1，优选Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo基因3’端部分；
3)将含有所述目的基因片段的载体转化到微生物细胞内，优选为酵母，尤其是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞内；
4)将所述微生物内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了抗性表达盒2，优选截断型新霉素(G418)抗性表达盒2，所述表达盒2在5’至3’方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp2，优选Loxp71序列、抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分、含有雌激素受体(estrogenreceptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES-PuroR结构；
5)诱导CreERT2的重组酶活性，优选通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因，优选新霉素的抗性表达盒；
6)筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。


2.根据权利要求1的方法，其中在所述步骤2)中的抗性表达盒1中所包含的抗性基因a部分，优选新霉素抗性基因Neo的3’端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2中的抗性基因b部分，优选Neo基因5’端部分是功能互补的，优选地，所述Neo基因5’端部分和所述Neo的3’端部分是在92位截断的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始核苷酸共同编码的，更优选地，新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5’端部分的末尾2个核苷酸和Neo基因的3’端部分的起始处第一个核苷酸共同编码的，
并且所述步骤6)通过加入特异性针对所述抗性基因的试剂，优选抗生素G418来筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。


3.根据权利要求1或2的方法，其中在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄菁，杨波，卢娜，卢刚，
申请(专利权)人：黄菁，
类型：发明
国别省市：北京;11