一种改造的PPP1R12A环状RNA载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改造的PPP1R12A环状RNA载体及其应用，其特征是：改造的PPP1R12A环状RNA载体具有启动翻译的能力，如在中间加入一段具有翻译潜力的RNA，PPP1R12A环状RNA载体可稳定的表达该蛋白，进入到免疫动物体内可以产生该蛋白抗体，PPP1R12A环状RNA可以作为疫苗的载体，可用于为预防或治疗的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种改造的PPP1R12A环状RNA载体及其应用
本专利技术属生物
，具体地涉及改造的PPP1R12A环状RNA载体，该载体的适当位点插入一段翻译序列之后可以表达该蛋白，载体可以用于多种疫苗的载体。
技术介绍
疫苗接种是预防和控制传染病的有效手段，对人类健康产生了巨大的影响。疫苗的品种非常多，根据其性质主要分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、树突状细胞疫苗、DNA疫苗及mRNA疫苗等。此外，我国还将疫苗分为免疫规划疫苗和非免疫规划疫苗。mRNA疫苗是将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，进而扩大机体的免疫能力。mRNA疫苗是具有免疫性、安全性及灵活性的基因疫苗，相比传统疫苗，mRNA疫苗不仅能够刺激免疫系统产生平衡、长效的保护，而且能被以Toll样受体为主的受体识别，进入细胞在胞液中表达，通过刺激免疫系统产生B和T细胞等多种机制，达到预防流行病及抗肿瘤等作用。mRNA容易受到细胞外普遍存在的核糖核苷酸酶影响而迅速降解，可能在被目标细胞摄取前就失去编码蛋白质的功能。因此，mRNA疫苗稳定性较差、极易被降解问题是其广泛应用限制条件。目前，虽然可以从成体系、密码子优化和修饰核苷等入手提高mRNA自身的稳定，但其稳定性依然是mRNA疫苗最大的挑战。环状RNA(circRNA)是一类广泛存在于各种生物中的特殊的非编码RNA，与正常线性RNA不同,它的3'和5'末端连接在一起形成共价闭合环状结构,致使缺乏典型的末端结构(5'帽装结构和3'多聚腺苷酸化)，阻碍核酸外切酶对其降解作用，使得circRNA具有高度保守性和稳定性。研究显示，circRNAs可充当miRNA分子海绵,竞争内源性RNA,通过阻断病毒miRNA对其靶mRNA的抑制作用,发挥抑制病毒miRNA的生物学功能,从而调节病毒miRNA的活动。此外，circRNA也参与免疫系统的调节。有趣的是，一小部分circRNA可编码蛋白，发挥调控作用。因此，circRNA具有稳定性特点，为circ-mRNA疫苗的设计提供了较强的科学理论。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种改造的PPP1R12A环状RNA载体及其应用。本专利技术的目的是这样实现的，通过合成该改建了最后建立包含PPP1R12A环状RNA载体序列以及在第555与556脱氧核酸之前插入编码RNA序列的完成体，可较好的表达插入序列的蛋白，该载体插入适当序列后，可以用于在制备疫苗中的载体，包括现在的制备新冠病毒的疫苗（81460491）。本专利技术（优点）：该载体表达蛋白效率高，制作简单，保存容易，作用剂量低。编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法的专利给予了我们的专利很大参考，本专利技术在他们的基础上改进了载体在思路上有了新的突破。附图说明图1所示转染后的细胞表达了棘突蛋白。具体实施方式下面对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。实施例通过生物公司订购一段线性DNA，其序列为SEQIDNO.D1所示，该序列首尾包含PCR结合区扩增，T7启动子区以及，改造的PPP1R12A环状RNA载体，以及插入的编码新冠病毒棘突的改进后的RNA序列,插入位点为第555与556之间,为n501y突变，以及第三和第四氨基酸为脯氨酸。通过BeyoAmp™Extra-longDNAPolymerase酶进行扩增，引物序列为AGAGGTAAGCTGTCTGTCGG与CTTTTCTAGCCTGCTGCTGT,为SEQIDNO.D2和D3所示。扩增后得到大量的DNA用于下一阶段试验通过DNA模板合成相应的线状RNA，合成使用诺唯赞公司的T7HighYieldRNATranscriptionKit按说明书操作，合成结束后去除DNA模板，对产物回收提纯，过程中使用RNA酶抑制剂保护RNA合成。采用诺唯赞VAHTSCircularizationKitForMGI环化试剂盒对上一步得到的RNA产物进行环化，对产物回收提纯去除剩余的线状RNA分子,得到了序列为SEQIDNO.R1的环状RNA。将该RNAR1利用转染试剂例如阳离子脂质体，纳米高分子转染试剂等，转染到A549细胞，48小时后采用westernblot检测改环状RNA是否表达改进的棘突蛋白结果如图1所示，成功的表达了该蛋白。将该环状RNA与免疫递送剂制成疫苗，将该疫苗对小鼠进行免疫接种，接种后14天检测抗体，通过ELISA法检测小鼠的血清，每组5只，结果如下对照组仅注射递送剂制，结果均为阴性，低剂量组含2.5-3.0微克环状RNA的疫苗，5只均为弱阳性，高剂量组含5-6微克环状RNA的疫苗，3只阳性，2只弱阳性。U被1-甲基-3伪尿酰(ψ)所取代，可以提高安全性和降低免疫反应。序列表<110>昆明医科大学<120>一种改造的PPP1R12A环状RNA载体及其应用<130>1<140>1<141>2002-12-28<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>4496<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>1agaggtaagctgtctgtcggtaatacgactcactatagatcactcaactgactttaaaaa60gctttatcaacaaattctagctgaaaatcaaaagctgaaggcacagctacatcatacaaa120tatcgaactaacagatcttaaattacagttggaaaaggccacccagccctgtaagaccag180taataaatttctgtctactgatcattctattgaattgaaatccagagccaatcgcatctt240tcagaaaaggtaacctgaatttcagaaccagataataagagaattctcctttaccagtaa300gatatctttttcctgcttaggacaaacccattacttgtcactttggatatactttatttc360atcaaatctaagacattactcattttaaaacaccattgtgttacctactactgaaaaaaa420ggaaaggtgctaccaattaaactataatccatcatcaattgtaagccattttctggtttt480ggaaatattaaaatctgggaggaagtgtacaatttaaaatattaatcattatatgggctg540gagctgcattattctgtttctggtggcgac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改造的PPP1R12A环状RNA载体，其特征在于：该RNA载体首尾相连呈环状，其序列为SEQ ID NO.R2所示或其具有至少85％同源性序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种改造的PPP1R12A环状RNA载体，其特征在于：该RNA载体首尾相连呈环状，其序列为SEQIDNO.R2所示或其具有至少85％同源性序列。


2.根据权利要求1所述的改造的PPP1R12A环状RNA载体，其特征在于翻译序列的插入位点为第555与556之间。


3.根据权利要求2所述的改造的PPP1R12A环状RNA载体，其特征在于：插入位点的翻译序列为SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：何越峰，周倩，尹锦瑶，孙明军，毛一竹，谭婧文，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南;53