TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用技术

本申请提供一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用。本申请构建的人源化TNFRSF1B基因改造动物模型能够加速与人TNFRSF1B基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如利用人源化TNFRSF1B基因改造动物模型代替人试药，为进行TNFRSF1B靶点药物的临床前实验提供有效的模型和有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用
本申请涉及基因工程
，尤其涉及一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用。
技术介绍
TNFRSF1B(TNFreceptorsuperfamilymember1b)为TNF受体超家族成员，也称为TNFR2，表达仅限于抑制性免疫细胞，尤其是调节性T细胞(Tregs)、髓系抑制性细胞(MDSCs)、内皮细胞和生长过程中的选择神经元。其配体TNF主要识别TNFR1进行凋亡，依赖TNFRSF1B进行与T细胞存活相关的功能——通过激活NFκB诱导激酶(NIK)诱导NFκB的非规范性激活，从而促进Tregs细胞增殖和生存。许多实验表明TNFRSF1B拮抗型抗体可以抑制肿瘤细胞和Tregs的增殖，理论上可用于多种肿瘤的治疗；而激动型抗体可以促进Tregs增殖和活化，进而抑制效应T细胞(Teffs)，从而治疗自身免疫疾病，为免疫治疗提供了新的靶点。目前，使用TNFRSF1B拮抗型抗体抑制Tregs，恢复肿瘤免疫应答并消除肿瘤，已经成为了肿瘤免疫治疗的有效策略。而人源TNFRSF1B靶点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，但由于种属性的差异，人源TNFRSF1B与鼠源Tnfrsf1b蛋白的同源性只有62％，在小鼠上筛选的靶点药物并不完全适用于人类，同样针对人源TNFRSF1B蛋白的药物也不一定能够识别小鼠的Tnfrsf1b蛋白。因此，构建具有人源TNFRSF1B靶点的人源化小鼠模型，在筛选评价人源TNFRSF1B靶点药物中具有非常高的应用价值。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法、TNFRSF1B基因人源化动物细胞、TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法以及由该方法制得的TNFRSF1B基因人源化动物模型的应用、来源于人源化TNFRSF1B基因改造动物模型或其子代的细胞或细胞系或细胞培养物的组织或器官及其应用，以加速与人TNFRSF1B基因或蛋白相关的领域的研究进展。为实现以上目的，本申请提供一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，包括：在非人动物细胞内导入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人动物细胞中表达产生人源化的TNFRSF1B蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因的表达。在一些实施例中，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因进行改造，得到人源化TNFRSF1B基因；优选地，所述非人动物为啮齿类动物；更优选地，所述啮齿类动物为小鼠；优选地，所述细胞为受精卵细胞。在一些实施例中，所述人源化TNFRSF1B基因选自下列组中的至少一种：(a)所述人源化TNFRSF1B基因的CDS编码序列如SEQIDNO：8所示；(b)所述人源化TNFRSF1B基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：9所示；(c)所述人源化TNFRSF1B基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：10所示。在一些实施例中，所述构建方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现；所述构建方法具体包括：提供人TNFRSF1B基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。在一些实施例中，所述非人动物为小鼠，所述人TNFRSF1B基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人TNFRSF1B基因、小鼠Tnfrsf1b基因、polyA以及3’同源臂。在一些实施例中，所述人TNFRSF1B基因的序列包括人TNFRSF1B基因内含子1的部分序列与人TNFRSF1B基因的部分编码区序列，所述人TNFRSF1B基因内含子1的部分序列如SEQIDNO：1所示，所述人TNFRSF1B基因的部分编码区序列如SEQIDNO：2所示；优选地，所述小鼠Tnfrsf1b基因的序列如SEQIDNO：3所示；优选地，所述小鼠Tnfrsf1b基因与所述polyA之间还设置有WPRE调控元件，所述WPRE调控元件的序列如SEQIDNO：4所示；优选地，所述polyA的序列如SEQIDNO：5所示；优选地，所述5’同源臂的DNA序列如SEQIDNO：10所示；优选地，所述3’同源臂的DNA序列如SEQIDNO：11所示。具体的，插入人TNFRSF1B基因内含子1的部分序列的目的在于：mRNA前体到成熟mRNA需要依赖剪切体(spliceosome)将mRNA前体中的内含子切除，直接用人源化TNFRSF1B基因编码区及WPRE-polyA序列替换小鼠Tnfrsf1b基因的外显子2时，由于人TNFRSF1B基因和鼠Tnfrsf1b基因的内含子1和外显子2之间的转录剪切位点存在差异，因此可能会影响人源化TNFRSF1B基因的mRNA的正常剪切，本申请在用人源化TNFRSF1B基因的编码区及WPRE-polyA序列替换小鼠Tnfrsf1b基因的外显子2的同时，用人TNFRSF1B基因的内含子1与外显子2交界处的一段内含子1的序列替换与之对应长度的鼠Tnfrsf1b序列，可以更好的保证人源化TNFRSF1B基因的mRNA的正确剪切。具体的，如SEQIDNO：2所示的所述人TNFRSF1B基因的部分编码区序列为TNFRSF1B蛋白的胞外区序列，可作为抗体结合位点或者药物作用靶点。具体的，如SEQIDNO：3所示的所述小鼠Tnfrsf1b基因的序列为小鼠Tnfrsf1b蛋白的跨膜和胞内区序列，插入该序列的目的在于：小鼠Tnfrsf1b是一个跨膜蛋白，其胞外段感受到的细胞外信号刺激，需要通过跨膜和胞内部分与其它蛋白(鼠源蛋白)相互作用进行信号转导，因此在人源化时，保留跨膜和胞内区序列为鼠源序列，可以更好地保证人源化后Tnfrsf1b正常的信号转导不受影响。具体的，通过插入WPRE调控元件，能够提高插入的融合基因片段(包括人TNFRSF1B基因与小鼠Tnfrsf1b基因)的表达能力。在一些实施例中，所述sgRNA的靶位点序列如SEQIDNO：20-29任一项所示；优选地，所述sgRNA的靶位点序列如SEQIDNO：29所示。本申请还提供一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞，所述TNFRSF1B基因人源化动物细胞由上述TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法获得。本申请还提供一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法，将上述TNFRSF1B基因人源化动物细胞或者由所述TNFRSF1B基因人源化动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。在一些实施例中，所述TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法还包括：还包括：将所述F0代阳性动物与野生型动物交配，扩大种群数量，同时杂合子动物与杂合子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：/n在非人动物细胞内导入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人动物细胞中表达产生人源化的TNFRSF1B蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：
在非人动物细胞内导入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人动物细胞中表达产生人源化的TNFRSF1B蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因的表达。


2.根据权利要求1所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因进行改造，得到人源化TNFRSF1B基因；
优选地，所述非人动物为啮齿类动物；更优选地，所述啮齿类动物为小鼠；
优选地，所述细胞为受精卵细胞。


3.根据权利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人源化TNFRSF1B基因选自下列组中的至少一种：
(a)所述人源化TNFRSF1B基因的CDS编码序列如SEQIDNO：8所示；
(b)所述人源化TNFRSF1B基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：9所示；
(c)所述人源化TNFRSF1B基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：10所示。


4.根据权利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现；所述构建方法具体包括：提供包括人TNFRSF1B基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。


5.根据权利要求4所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述非人动物为小鼠，所述人TNFRSF1B基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人TNFRSF1B基因、小鼠Tnfrsf1b基因、polyA以及3’同源臂。


6.根据权利要求5所述的TNF...

【专利技术属性】
技术研发人员：费俭，孙瑞林，王津津，周宇，池骏，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司，上海砥石生物科技有限公司，广东南模生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31