人源化KDR基因改造动物模型的构建方法及其应用技术

本申请提供一种人源化KDR基因改造动物模型的构建方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本申请构建的人源化KDR基因改造动物模型能够加速与人KDR基因或蛋白相关的领域的研究进展。优选的，本申请利用同源重组基因编辑技术，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的Kdr基因替换为人源的KDR基因，构建能与抗人源KDR抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人KDR基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

【技术实现步骤摘要】
人源化KDR基因改造动物模型的构建方法及其应用
本申请涉及基因工程
，尤其涉及一种人源化KDR基因改造动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
癌症是全球面临的主要的公共健康问题，人类癌症的发生率以及死亡率仍在上升。随着老龄化的加剧和人口的增长，21世纪癌症有望成为导致死亡的首要原因，并且癌症已经成为公共医疗的沉重负担。血管生成是肿瘤发生，发展过程中的必要步骤：在肿瘤生长过程中，当肿瘤的直径>2mm时，仅靠组织内的扩散已不能获取需要的养分以及氧气，需要新生血管生成，为癌细胞提供营养和氧气供应，供癌细胞生长扩增。1971年，Folkman等提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成，进一步提出以肿瘤血管生成为靶点，通过肿瘤血管生成抑制剂破坏或抑制肿瘤血管生成，“饿死”肿瘤的抗肿瘤疗法。进一步的研究发现，肿瘤血管在为肿瘤细胞提供营养物质和氧气的同时，因其结构异常，还会形成高渗、低氧、酸性、高压的微环境，进而影响免疫细胞的增生、浸润、存活和发挥功能，造成肿瘤对化疗、放疗以及免疫治疗的抵抗。Jain等提出了肿瘤血管正常化理论：合理地运用抗血管生成药物，在特定时间窗内使肿瘤血管在结构和功能上趋于正常，最终提高抗肿瘤效果并抑制肿瘤转移。大量研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang)等因子，在肿瘤组织中均会过度表达，并在促进肿瘤血管形成、生长过程中发挥重要作用。针对这些促血管生成因子，研发了一系列药物分子，其中，针对VEGF/VEGFR(血管内皮细胞生长因子受体)信号通路的药物是发展最快、最为成功的，已有多款药物上市，如针对VEGF的贝伐珠单抗，针对VEGFR的雷莫芦单抗等。VEGF是一类糖蛋白，人类VEGF家族包括VEGFA、VEGFB等6个成员，VEGF能选择性地作用于VEGFR。VEGFR是一类酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要分布于血管内皮细胞表面，包含VEGFR1、VEGFR2(又称KDR)和VEGFR3共3个成员。VEGF通过与VEGFR的胞外段结合，使VEGFR构象改变，形成二聚体，使其胞内段酪氨酸位点发生磷酸化，激活下游信号转导通路，促进血管生成。其中，VEGFR2(KDR)是血管内皮细胞上最重要的促内皮细胞增殖和分化信号转导蛋白，KDR除了在肿瘤血管新生方面发挥重要作用，近来的研究表明，其在调控肿瘤微环境方面，也发挥重要作用，KDR抗体可以逆转VEGF对T细胞的抑制作用。因此，针对KDR的抑制剂既可以通过抑制血管生成，也可以通过改善肿瘤微环境，增强免疫细胞的免疫功能发挥抗肿瘤的作用。目前针对KDR靶点，礼来公司已有一个大分子抗体药物——雷莫芦单抗(Cyramza，Ramucirumab)上市，国内很多公司针对KDR的大分子抗体药物正在开发中，如科伦药业、康方生物、三生制药、步长制药等均布局该靶点；除了大分子药物外，国内也有多家公司针对KDR的小分子激酶抑制剂已经或者即将上市，如恒瑞医药的阿帕替尼和记黄埔的索凡替尼等。在药物临床前研究中，小鼠被广泛的应用于药效评价、药理毒理分析等研究，应用于这些研究的前提是，作用于人源靶点的药物能够结合小鼠对应的靶点，如受试药物不能和鼠源靶点结合，则不能利用小鼠进行药效、药理毒理等评价。因开发的针对人源靶点药物不能识别动物的靶点分子，导致无法用动物进行药效、药理毒理评价的矛盾，在大分子抗体药物中尤为突出，因为大分子抗体药物可能只识别由几个氨基酸组成的一个靶位点，动物和人之间靶点分子1个氨基酸的差异，都有可能导致药物不识别动物体内的靶点，进而影响后续的药物评价，延长研发周期，增加不确定性。人和小鼠KDR蛋白氨基酸序列的一致性仅为85％，胞外区氨基酸的一致性更低，仅为79.9％(胞外区是针对KDR靶点的抗体大分子药物的主要作用区域)，这种氨基酸序列的差异造成已上市的针对KDR靶点的雷莫芦单抗就无法识别小鼠的Kdr蛋白，无法利用小鼠对雷莫芦单抗的药效、毒理、安全性等进行评价。为了减少人鼠之间的这种差异，对野生型小鼠进行人源化改造可以很好的‘再现’人体的微环境，在用于药效评价的同时，也可以应用于对药物的毒性和安全性评价。目前，人源化小鼠模型已经广泛应用于肿瘤，病毒感染等疾病研究领域。如今，基因工程技术已经发展的比较成熟，利用基因修饰的手段对靶点分子进行人源化改造，建立人源化动物模型研究人类疾病可以很好的解决人类和动物之间的靶点差异问题：经过基因修饰以后，人源化模式动物体内可以全部或部分的表达相应的人类蛋白，模仿人体疾病发生时各种分子之间的相互作用，重现人体疾病的特征，大大缩小临床前动物模型和人体之间的差异，使药物筛选在动物整体水平的筛选研究成为可能；同时，该类模型使我们可以在免疫系统正常的模型上，对药物的毒性和药物代谢进行评价，可以更好的贴合临床药物功效，提高药物筛选成功的概率。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种人源化KDR基因改造动物模型的构建方法及其应用，以加速与人KDR基因或蛋白相关的领域的研究进展。为实现以上目的，本申请首先提供一种人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，包括：在非人动物细胞内导入人KDR基因，使得该人KDR基因在非人动物细胞中表达产生人源化的KDR蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源KDR基因的表达。本申请一些实施例中，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源KDR基因进行改造，得到人源化KDR基因；优选的，所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法包括：将小鼠Kdr基因的第4号到第14号外显子的全部序列以及第15号外显子的一部分序列替换为人KDR基因的第4号到第14号外显子的全部序列以及第15号外显子的一部分序列；优选的，所述细胞为胚胎干细胞。可以理解的是，小鼠的Kdr基因的第4号到第14号外显子的全部序列以及第15号外显子的一部分序列对应的编码蛋白序列为KDR蛋白胞外区序列。所述非人动物细胞为胚胎干细胞时，通过对胚胎干细胞进行基因编辑，获得人源化KDR基因细胞，将该人源化KDR基因细胞转移至野生型小鼠的囊胚中，经胚胎移植发育后可获得F0代嵌合体动物。本申请一些实施例中，所述人源化KDR基因选自下列组中的至少一种：(a)所述人源化KDR基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；(b)所述人源化KDR基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：7所示；(c)所述人源化KDR基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：8所示。本申请一些实施例中，所述构建方法具体包括：提供人KDR基因同源重组载体，将所述人KDR基因同源重组载体导入小鼠细胞中，将所述小鼠细胞转移至培养液中进行培养；优选的，所述人KDR基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人源化KDR基因编码区、抗性基因表达框以及3’同源臂；所述人源化KDR基因编码区与所述抗性基因表达框之间、所述抗性基因表达框与所述3’同源臂之间均设有能够被重组酶识别的特异性位点；优选的，所述特异性位点为FRT位点。...

【技术保护点】
1.一种人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：/n在非人动物细胞内导入人KDR基因，使得该人KDR基因在非人动物细胞中表达产生人源化的KDR蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源KDR基因的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：
在非人动物细胞内导入人KDR基因，使得该人KDR基因在非人动物细胞中表达产生人源化的KDR蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源KDR基因的表达。


2.如权利要求1所述的人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源KDR基因进行改造，得到人源化KDR基因；
优选的，所述非人动物为啮齿类动物；
优选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法包括：将小鼠Kdr基因的第4号到第14号外显子的全部序列以及第15号外显子的一部分序列替换为人KDR基因的第4号到第14号外显子的全部序列以及第15号外显子的一部分序列；
优选的，所述细胞为胚胎干细胞。


3.如权利要求2所述的人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人源化KDR基因选自下列组中的至少一种：
(a)所述人源化KDR基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；
(b)所述人源化KDR基因转录的mRNA序列如SEQIDNO：7所示；
(c)所述人源化KDR基因编码的蛋白序列如SEQIDNO：8所示。


4.如权利要求2所述的人源化KDR基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括：提供人KDR基因同源重组载体，将所述人KDR基因同源重组载体导入小鼠细胞中，将所述小鼠细胞转移至培养液中进行培养；
优选的，所述人KDR基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人源化KDR基因编码区、抗性基因表达框以及3’同源臂；
所述人源化KDR基因编码区与所述抗性基因表达框之间、所述抗性基因表达框与所述3’同源臂之间均设有能够被重组酶识别的特异性位点；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：费俭，孙瑞林，王津津，周宇，茅文莹，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司，上海砥石生物科技有限公司，广东南模生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31