一种SIGLEC15基因人源化动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术通过筛选获得了用于小鼠高效同源重组的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种SIGLEC15基因人源化动物模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及人源化基因修饰动物模型的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种SIGLEC15基因人源化基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞在发生发展过程中发展出各种免疫逃逸机制来逃避肿瘤微环境(TME)中针对肿瘤特异性和非特异性的攻击。因此，单纯的某一种免疫系统的全身性激活甚至外周肿瘤特异性T细胞的增加并不一定能介导肿瘤消退。同时，目前已知的癌症免疫逃逸策略也被用于维持体内的免疫系统稳态。为了杀伤肿瘤细胞，针对这些免疫逃逸机制，激活的非特异性免疫反应越多，发生不良事件的风险也就越高，进而导致治疗成功的可能性降低。
[0003]开发免疫正常化疗法的关键在于靶向肿瘤诱导的免疫逃逸机制，这些机制应限于TME，并选择性地恢复TME中针对肿瘤的免疫反应。因此，肿瘤免疫治疗正常化的靶标需要具备以下特点：1）由于肿瘤生长和/或随后的免疫监视而诱导产生；2）优先在TME中表达，在正常组织中不表达或少量表达；3）TME中的表达能够引发免疫逃逸，阻断或控制其表达可以重置或重编程TME中的抗肿瘤免疫。
[0004]肿瘤免疫治疗中，针对PD
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L1/PD
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1信号通路的免疫检查点抑制剂是最为成功的案例，阻断PD
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L1/PD
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1信号通路进行抗肿瘤治疗，即为肿瘤免疫治疗正常化的原型。PD
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L1蛋白在正常人体组织中的表达水平很低，但在一些肿瘤患者中可以被选择性诱导过度表达，并且这种诱导局限于肿瘤微环境中。因此，阻断PD
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L1/PD
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1可避免全身过度免疫反应，避免对正常组织的严重损伤，同时又可以选择性地使TME中的免疫功能正常化和复位。然而，PD
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L1/PD
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1在人类实体肿瘤中只负责部分免疫功能失调，尽管针对该通路的抑制性药物取得了巨大成功，但只有30
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40%的患者有响应，大多数患者表现出原发性或获得性耐药性。因此，需要在 TME 中鉴定新的下一代可媲美PD
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L1/PD
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1的免疫治疗靶标。
[0005]Siglec15 (S15) 为Siglec家族(唾液酸结合免疫球蛋白凝集素)的成员之一，该家族是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一个独特亚群，参与识别自身和非自身免疫调节。以前的研究表明，Siglec
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15在破骨细胞分化和骨重建中的作用，但其免疫功能仍然很大程度上未知。2019年4月，Nature Medicine上刊登了陈列平教授团队的文章（Nature Medicine， volume 25, pages656
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666 (2019)）。他们的研究表明，S15是一种关键的免疫抑制因子，其通常仅在某些骨髓细胞上表达，但在人类肿瘤细胞和肿瘤浸润性骨髓细胞上广泛上调，抑制肿瘤免疫，并且这种肿瘤抑制性能够以独立于PD
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L1/PD
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1通路的方式介导。此外，该研究显示S15敲除小鼠未发生自身免疫或其他疾病，表明Siglec15抑制可能不会引起正常细胞的不良反应。这些证据暗示，S15靶点可成为针对PD
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1靶向治疗无应答的癌症患者的潜在治疗靶点，其可能是开发免疫系统正常化下一代免疫药物的一个重要靶点。目前针对S15靶点已有两个药物进入临床阶段，一个是美国NextCure公司开发的NC
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318,处于临床II期阶段，一个是日本第一三共株式会社开发的DS
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1501，处于临床I期阶段；国内也有多家公司针对
S15靶点进行临床前的研发。
[0006]在药物临床前研究中，小鼠被广泛的应用于药效评价、药理毒理分析等研究，应用于这些研究的前提是，作用于人源靶点的药物需能够结合或激活小鼠对应的靶点，如受试药物不能和鼠源靶点结合或激活下游信号通路，则不能利用小鼠进行药效、药理毒理等评价。通过对人和小鼠的SIGLEC15蛋白比较发现，人和小鼠的SIGLEC15蛋白氨基酸一致性只有77.9%。这种人鼠蛋白氨基酸序列的差异，很可能造成针对人S15靶点的药物不能识别鼠源S15靶点，尤其是抗体类药物，识别位点一个氨基酸的差异都可能造成抗体无法识别靶位点。因此，很可能无法用野生型小鼠模拟针对人源SIGLEC15的信号转导、疾病模型建立、药物评价和筛选研究，而动物模型实验作为临床前药物研究的必备环节，模型缺失可能成为药物研发的瓶颈。
[0007]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即利用基因修饰操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同源基因，可在动物体内建立更接近人类疾病特征的正常或突变基因的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可提高药物对体内药靶的识别性，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达人类功能的蛋白质，从而大大减少临床前动物实验与临床实验结果的差异，为在临床前动物体内水平进行药物筛选和验证提供了可能。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种SIGLEC15基因人源化改造的非人动物模型的构建方法，利用同源重组的方式用人SIGLEC15的相关序列替换动物内源的SIGLEC15序列，使该模型体内能正常表达人源的SIGLEC15蛋白，从而应用于针对SIGLEC15信号机制研究，针对炎症、自身免疫行疾病、肿瘤和抗病毒的药物筛选和评价，无论对SIGLEC15基因功能机制还是药物研发都具有重要的应用价值。
[0009]本专利技术公开了一种SIGLEC15基因人源化非人动物模型的构建方法，所述的构建方法包括使用靶向SIGLEC15基因的gRNA和同源重组载体进行构建。
[0010]优选的，所述gRNA靶向5
’
端的序列如SEQ ID NO:12所示，所述gRNA靶向3
’
端序列如SEQ ID NO:26所示。
[0011]优选的，所述同源重组载体包括5
’
同源臂、人SIGLEC15基因片段、3
’
同源臂，所述人SIGLEC15基因片段的编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]优选的，所述的非人动物体内表达人SIGLEC15基因编码的蛋白。
[0013]优选的，所述同源重组载体包括的5
’
同源臂的序列如SEQ ID NO:6所示，所述同源重组载体包括的3
’
同源臂的序列如SEQ ID NO:7所示。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SIGLEC15基因人源化非人动物模型的构建方法，所述的构建方法包括使用靶向SIGLEC15基因的gRNA和同源重组载体进行构建，其特征在于，所述靶向SIGLEC15基因的gRNA包括靶向5
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端的gRNA和靶向3
’
端的gRNA，所述靶向5
’
端的gRNA识别的靶位点序列如SEQ IDNO:12所示，所述靶向3
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端的gRNA识别的靶位点序列如SEQ ID NO:26所示，所述同源重组载体包括5
’
同源臂、人SIGLEC15基因片段、3
’
同源臂，所述人SIGLEC15基因片段编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示，所述的非人动物体内表达人SIGLEC15基因编码的蛋白。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体包括的5
’
同源臂的序列如SEQ ID NO:6所示，所述同源重组载体包括的3
’
同源臂的序列如SEQ ID NO:7所示。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述人SIGLEC15基因部分破坏内源SIGLEC15基因的编码框，使内源的SIGLEC15基因不表达。4.根据权利要求1
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3任一权利要求所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为小鼠。5.根据权利要求4所述的构建方法，所述人SIGLEC15基因片段的序列如SEQ ID NO:5所示。6.一种用于构建SIGLEC15基因人源化非人动物模型的同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体包括5
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同源臂、人SIGLEC15基因片段、3
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同源臂，所述同源重组载体包括的5
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同源臂的序列如SEQ ID NO:6所示，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙瑞林，王津津，杨平，慈磊，何敏珠，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司上海砥石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：