人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及应用，涉及基因工程领域。本发明专利技术成功制备CD40基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达人源化CD40蛋白，可用于CD40基因功能研究、人源CD40抗体的筛选和评价。利用本发明专利技术制备的动物模型可用于针对人CD40靶位点的药物筛选、药效研究、免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究CD40蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。

【技术实现步骤摘要】
人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及应用。
技术介绍
近些年来，随着针对PD-1、CTLA4等免疫检查点靶点药物的上市，肿瘤治疗正处于“免疫变革”的风口浪尖，肿瘤免疫治疗已经成为继放疗、化疗和靶向治疗后新的治疗方式。目前的肿瘤免疫治疗中最成功的是针对免疫检查点开发的药物，可以概括为两种主要类型：一种是利用靶向分子，解除免疫抑制性检查点分子对免疫系统杀伤肿瘤细胞的抑制作用，从而杀伤肿瘤；CTLA-4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体等药物都属于这一类。另一种是利用靶向分子，激活有助于免疫系统杀伤肿瘤的免疫检查点激活性分子，使该类分子的肿瘤杀伤作用更有效，更持久；免疫激动剂就属于这类药物，是目前全球肿瘤免疫研发的新热点。CD40是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，和OX40、4-1BB等均属于免疫刺激分子，是一个关键的免疫共刺激受体，其在各种免疫和非免疫细胞(包括B细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、小胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞和角质形成细胞)表面组成型或诱导性表达。它的配体CD40L(CD154)在活化的CD4+T细胞表面瞬时表达，在自身免疫性疾病中也在其他类型细胞中表达。CD40和CD154在细胞表面相互作用后，通过在细胞内膜中募集TNFR相关因子(TRAF)促进细胞内信号传导，激活不同的信号通路，例如经典和非经典核因子κB通路、丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和磷脂酶Cγ通路等，参与机体的体液免疫和细胞免疫反应：在B细胞的活化、增殖与分化、抗体产生及Ig类别转换中起关键作用，在T细胞活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起到重要调节作用。CD40-CD154之间的相互作用，可以通过活化先天免疫和适应性免疫，从而产生抗肿瘤免疫效果：树突状细胞上的CD40与T细胞上的CD154之间相互作用，导致T细胞活化；同时，CD40也会导致B细胞和巨噬细胞活化，进而导致中性粒细胞、NK细胞活化，最终激活T细胞，进而产生抗肿瘤效果。另外，CD40-CD154的相互作用，除了肿瘤免疫治疗外，也是其他免疫相关疾病的靶点，据报道，通过基因或抗体介入手段调节CD40-CD154的相互作用，对动脉硬化RA、克罗恩病、脑脊髓炎(EAE)等在小鼠模型上都具有一定疗效作用。鉴于CD40靶点在先天性免疫和适应性免疫中的重要作用，据不完全统计，目前已有超过25种针对CD40靶点的药物进入临床，其中诺华、百时美施贵宝、艾伯维等药企的15种药物已经处于临床II期阶段，涉及的适应症除了神经胶质瘤、非小细胞肺癌、胃癌、黑色素瘤等肿瘤外，还有银屑病、关节炎、克罗恩氏病等自身免疫系统疾病。因此，CD40靶点已经成为肿瘤免疫治疗和自身免疫疾病治疗的热门靶点。人类CD40基因在小鼠中的同源基因为Cd40，两者具有相似的基因结构，但在氨基酸一致性方面，人源和鼠源CD40蛋白的氨基酸一致性只有61％，胞外区氨基酸序列的一致性只有59％，这种氨基酸序列一致性方面的差异很可能导致针对人的CD40靶点的药物无法识别小鼠的Cd40靶点，无法利用野生型小鼠对药物进行体内药效评价。另外，免疫疗法治疗癌症虽有一定成效，但若免疫应答程度过强，会对健康组织造成很大的伤害，造成免疫毒副反应，因此在进行药效评价的同时也需要对受试药物的毒性安全性等方面进行严格的筛选。但常用的野生型小鼠，因为人鼠靶点差异，药物无法识别小鼠体内的靶点，也不适合于毒性和安全性评价。为了减少人鼠之间的这种差异，对野生型小鼠进行人源化改造可以很好的‘再现’人体的微环境，在用于药效评价的同时，也可以应用于对药物的毒性和安全性评价。目前，人源化小鼠模型已经广泛应用于肿瘤、病毒感染等疾病研究领域。
技术实现思路
利用基因修饰的手段对靶点分子进行人源化改造，建立人源化动物模型研究人类疾病可以很好的解决人类和动物之间的靶点差异问题：经过基因修饰以后，人源化模式动物体内可以全部或部分的表达相应的人类蛋白，模仿人体疾病发生时各种分子之间的相互作用，重现人体疾病的特征，大大缩小临床前动物模型和人体之间的差异，使药物筛选在动物整体水平的筛选研究成为可能；同时，该类模型使我们可以在免疫系统正常的模型上，对药物的毒性和药物代谢进行评价，可以更好的贴合临床药物功效，提高药物筛选成功的概率。本专利技术的目的在于提供一种人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法、人源化CD40基因改造动物细胞、人源化CD40基因改造动物模型的构建方法以及由该方法制得的人源化CD40基因改造动物模型的应用、来源于人源化CD40基因改造动物模型或其子代的细胞或细胞系或细胞培养物的细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官及其应用、嵌合CD40蛋白、编码所述嵌合CD40蛋白的嵌合CD40基因、包含所述嵌合CD40蛋白的重组载体、包含所述重组载体的细胞、包含所述细胞的组织，以加速与人CD40基因或蛋白相关的领域的研究进展。为实现以上目的，本专利技术首先提供一种人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，包括：将非人动物细胞内的非人源CD40基因的第2号到第5号外显子的序列替换为人CD40基因的第2号到第5号外显子的序列，形成人源化CD40基因，得到人源化CD40基因改造动物细胞；优选的，所述非人动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠；优选的，所述细胞为受精卵。具体的，鼠Cd40蛋白的第2号到第5号外显子的序列为胞外区。进一步优选的，所述小鼠为C57BL/6小鼠。在一些实施例中，所述人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法包括：提供人CD40基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物导入所述非人动物细胞中。具体的，可以通过显微注射的方法来将所述混合物导入所述非人动物细胞中。在一些实施例中，所述sgRNA的5’端靶位点位于小鼠Cd40基因的1号内含子中，所述sgRNA的3’端靶位点位于小鼠Cd40基因的5号内含子中。优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：28-37任一项所示；更优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：22所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：36所示。在一些实施例中，所述人CD40基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CD40基因片段及3’同源臂；优选的，所述人CD40基因片段的序列如SEQIDNO：11所示；优选的，所述5’同源臂的序列如SEQIDNO：9所示，所述3’同源臂的序列如SEQIDNO：10所示。在一些实施例中，所述人源化CD40基因选自下列组中的至少一种：(a)所述人源化CD40基因的CDS编码序列如SEQIDNO：6所示；(b本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：/n将非人动物细胞内的非人源CD40基因的第2号到第5号外显子的序列替换为人CD40基因的第2号到第5号外显子的序列，形成人源化CD40基因，得到人源化CD40基因改造动物细胞；/n优选的，所述非人动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠；/n优选的，所述细胞为受精卵。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：
将非人动物细胞内的非人源CD40基因的第2号到第5号外显子的序列替换为人CD40基因的第2号到第5号外显子的序列，形成人源化CD40基因，得到人源化CD40基因改造动物细胞；
优选的，所述非人动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠；
优选的，所述细胞为受精卵。


2.根据权利要求1所述的人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法包括：
提供人CD40基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物导入所述非人动物细胞中。


3.根据权利要求2所述的人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的5’端靶位点位于小鼠Cd40基因的1号内含子中，所述sgRNA的3’端靶位点位于小鼠Cd40基因的5号内含子中；
优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：28-37任一项所示；
更优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：22所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：36所示。


4.根据权利要求2所述的人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人CD40基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CD40基因片段及3’同源臂；
优选的，所述人CD40基因片段的序列如SEQIDNO：11所示；
优选的，所述5’同源臂的序列如SEQIDNO：9所示，所述3’同源臂的序列如SEQIDNO：10所示。


5.根据权利要求1所述的人源化CD40基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：费俭，孙瑞林，王津津，周宇，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司，上海砥石生物科技有限公司，广东南模生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31