一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型构建方法技术

本发明专利技术提供了控制同一靶基因在宿主中以不同剂量进行表达的方法及产品，在插入序列中，外源强启动子两端设置了两个终止元件，每个终止元件两端具有不同的重组酶识别位点序列，当插入到宿主基因组编码外显子之前的内含子之中时，两个终止元件将阻止启动子的功能从而抑制靶基因表达，而通过不同的重组酶控制相应的终止元件及启动子的剔除实现内源启动子或外源强启动子调控的基因低剂量或高剂量表达。

【技术实现步骤摘要】
一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型的构建方法。
技术介绍
利用基因过表达制备细胞或者动物模型，是研究基因功能的常用技术，广泛应用于生命科学和医学基础研究以及临床前转化研究。常用的转基因动物模型为研究早期发育、疾病的发病过程和临床前药物评价提供了强有力的工具。研究发现，在这些模型中基因的表达剂量和表型密切相关，如：FUS基因发现与肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）有关，在过表达野生型人FUS基因的转基因纯合子小鼠中（FUS蛋白表达量是对照组的1.9倍），早期出现震颤，随后后肢逐渐瘫痪，12周的时候小鼠死亡；然而在过表达野生型人FUS基因的转基因杂合子小鼠中（FUS蛋白表达量是对照组的1.4倍），没有出现运动障碍的表型或者病理病变。这说明人FUS基因过表达导致进行性神经元病变是剂量依赖的(JacquelineC.Mitchelletal.,Overexpressionofhumanwild-typeFUScausesprogressivemotorneurondegenerationinanage-anddose-dependentfashion.ActaNeuropathol(2013)125:273–288,DOI10.1007/s00401-012-1043-z）。同样的情况也发生在人源TLR8转基因小鼠模型中(CristianaGuiducci,et.al,RNArecognitionbyhumanTLR8canleadtoautoimmuneinflammation,J.Exp.Med.2013Vol.210No.132903-2919),人源TLR8的表达会导致小鼠自身免疫性疾病的发生，小鼠的存活率及表型和人TLR8的表达量呈明显的负相关。由此可见，不同剂量的基因表达水平，可以使基因展现出不同的生物学功能；不同剂量的表达模型可以为我们理解基因功能提供更全面的线索。而我们目前常用的不同表达剂量模型，通常有：1）杂合子和纯合子动物模型间的基因表达剂量差异，但两种基因型间的基因表达水平差异有限；2）通过传统的随机转基因方式，因为插入位点和基因拷贝数不同，可以获得不同表达水平的动物模型，但因为常规的转基因模型需要复杂的建系过程，从多个品系中筛选出可传代，目的基因表达的动物模型，增加了时间和成本。鉴于此，通过一种小鼠模型，高效获得两种或者多种不同表达剂量的模型，对于基因生命科学、医学研究具有重要意义，亦有需求，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可实现靶基因高、低两种剂量表达的基因修饰模型构建方法以及用于实施该方法的核酸序列、载体和宿主，利用该方法制备的细胞和动物模型中，可以实现敲入基因分别由内源启动子驱动表达，实现较低水平的转基因表达或由强启动子（如CAG启动子）来驱动目的基因高表达。根据本专利技术的一个方面，提供一种用于基因重组表达的核酸序列，其包含：外源强启动子序列和至少一个控制启动子序列功能的调控元件。优选地，所述在所述外源强自动子上游和下游各有一个控制启动子序列功能的调控元件，其能够调控外源强启动子和/或所述核酸序列插入位置的内源启动子的功能。优选地，所述调控序列为终止元件，其两端具有重组酶识别元件。本专利技术还提供了包含上述核酸序列的载体、宿主，以及构建所述载体和宿主的方法，所述方法包括讲所述核酸序列引入所述载体以及将所述核酸序列或载体引入所述宿主。进一步地，本专利技术还提供了利用所述核酸序列、载体或宿主表达外源基因的方法。敲入基因可以根据需求实现不同强度的过表达。具体的方法为：如图1所示，通过定点敲入的方式，将RNA剪接受体序列（SA）-重组酶1识别元件-终止元件1-CAG强启动子-重组酶1识别元件-重组酶2识别元件-终止元件2-重组酶2识别元件-靶基因-polyA片段插入基因编码外显子之前的内含子中。正常情况下，因为转录终止元件1和2的存在，所插入位置基因内源启动子和CAG强启动子的转录都被终止，目的基因不表达；当通过重组酶2作用后，STOP2元件将被剔除掉，目的基因为CAG强启动子所驱动，实现目的基因高表达；在此基础上，可通过重组酶1进一步作用，将STOP1元件和CAG启动子剔除掉，目的基因受插入位置基因内源启动子驱动表达，实现一个较低剂量表达。上述名词中，CAG启动子为巨细胞病毒（CMV）增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子和兔β-珠蛋白基因的剪接受体组合而成的一个人工启动子，具有较高的转录活性，强启动子也可以选择其他启动子，优选CAG启动子；重组酶识别元件为各种重组酶所识别的DNA序列，常用的有loxp，FRT,Rox序列等，重组酶1识别元件可以为loxp，FRT,Rox序列的任意一种，优选非loxp序列；重组酶2识别元件可以为loxp，FRT,Rox序列的任意一种，优选loxp序列；重组酶1识别元件和重组酶2识别元件需为不同种类的识别元件，对应的重组酶应为两种不同的重组酶；终止元件1为转录终止元件，发挥终止内源基因转录的作用，避免对外源强启动子表达有影响；终止元件2为转录或者翻译终止元件，用于终止强启动子的转录或者终止强启动子转录出mRNA的翻译，避免外源基因、蛋白表达。PolyA为Polyadenylation缩写，用于终止转录。本专利技术可以通过构建一个模型，实现靶基因的两种剂量表达，为观察不同靶基因表达剂量对基因功能的影响研究提供了简便的方法。附图说明为了更清楚的说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图做简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1是本
技术实现思路
的示意图。图2tdTomato-Luciferase条件性高低剂量过表达小鼠胚胎干细胞模型构建。图A为模型构建验证示意图；图B为tdTomato-Luciferase酶切验证结果。载体经EcoRI限制性内切酶，酶切后理论条带大小为9831bp、5617bp、3969bp、3640bp、932bp，结果符合预期（M为1kbDNAmarker）；图C为同源重组ES细胞鉴定电泳结果，上图为5’同源臂鉴定结果，下图为3’同源臂鉴定结果（M为1kbDNAmarker，图上方编号为ES细胞克隆编号）。图3tdTomato-Luciferase阳性ES细胞克隆目的基因高低剂量表达验证。图A为Cre作用后阳性ES细胞克隆PCR鉴定电泳结果；图B为Cre/Flp两种重组酶作用后阳性ES细胞克隆PCR鉴定电泳结果；图C为野生型ES细胞克隆、tdTomato-Luciferase阳性ES细胞克隆、Cre作用后阳性ES细胞克隆、Cre/Flp两种重组酶作用后阳性ES细胞克隆EGFP和tdTomato荧光表达检测结果；图D为野生型ES细胞克隆、tdTomato-Luciferase本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于基因重组表达的核酸序列，其包含：外源强启动子序列和至少一个控制启动子序列功能的调控元件。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于基因重组表达的核酸序列，其包含：外源强启动子序列和至少一个控制启动子序列功能的调控元件。


2.如权利要求1所述的核酸序列，在所述外源强启动子上游和下游各有一个控制启动子序列功能的调控元件。


3.如权利要求1-2的核酸序列，所述调控元件可调控外源强启动子和/或所述核酸序列插入位置的内源启动子的功能。


4.如权利要求1-3核酸序列，所述调控元件为终止元件。


5.如权利要求1-4核酸序列，所述调控元件两端具有重组酶识别元件。


6.如权利要求1-5所述的核酸序列，其在5’端至3’端依次具有RNA剪接受体序列（SA）-重组酶1识别元件-终止元件1-外源强启动子-重组酶1识别元件-重组酶2识别元件-终止元件2-重组酶2识别元件-靶基因。


7.如权利要求1-6所述的核酸序列，所述外源强启动子为CAG启动子。


8.如权利要求6-7所述的核酸序列，所述重组酶1识别元件和重组酶2识别元件需为不同种类的识别元件，对应的重组酶应为两种不同的重组酶。


9.如权利要求6-8所述的核酸序列，所述终止元件1为转录终止元件，终止元件2为转录或者翻译终止元件。


10.一种转...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙瑞林，王津津，周宇，茅文莹，李青，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技股份有限公司，上海砥石生物科技有限公司，广东南模生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31