一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1）、针对人AAVS1位点设计sgRNA并构建sgRNA‑CAG‑hCas9载体；2）、将sgRNA‑CAG‑hCas9载体转染至293T细胞验证sgRNA切割效率；3）、构建含NAMPT基因、抗性基因neo、转录终止序列BGH polyA、启动子EF‑1A重组载体；4）、将步骤2）中切割效率好的sgRNA‑CAG‑hCas9载体与步骤3）中构建的重组载体共转染间充质干细胞，G418筛选得到稳转细胞系；5）、收集高表达NAMPT稳转细胞系培养基，利用外泌体试剂盒提取，得到高表达NAMPT基因的人脐带间充质干细胞外泌体。通过本发明专利技术，较于慢病毒构建方法更加安全。

【技术实现步骤摘要】
一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法
本专利技术涉及一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，具体的涉及一种利用CRISPRCas9技术构建NAMPT基因敲入间充质干细胞的实验方法，属于生物

技术介绍
衰老是机体细胞、组织和器官等的结构和功能随着年龄的增长所发生的自然退化过程，是生命过程中的一种自然现象，同时也是引发代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管等系统重大疾病的发生和发展的重要因素。因此，如何有效的延缓衰老已成为生命科学领域研究热点之一，也是当今社会迫切需要解决的问题。外泌体是一类直径在30-150nm之间的纳米级囊泡，可由许多类型的细胞分泌产生，其内容物包含蛋白质、DNA、miRNA、lncRNA等，参与细胞间的物质交换和信息交流[3]。外泌体作为新型的药物载体具有良好的生物相容性、低免疫原性、来源广泛、稳定性好、递送效率高、膜修饰方式多样等优势，有望成为优良蛋白质药物递送的载体。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是NAD+生物补救合途径的主要限速酶，在细胞周期、细胞代谢、细胞衰老及DNA损伤修复等生理、病理活动中发挥着重要作用[8]。NAMPT在哺乳动物体内有两种存在形式：细胞内和细胞外NAMPT（iNAMPT和eNAMPT）。iNAMPT作为关键NAD+生物合成酶的功能已得到充分确立，而eNAMPT的生理相关性和功能长期以来一直存在争议。eNAMPT以前被鉴定为B前细胞集落增强因子（PBEF）和内脂肪素(visfatin)，至今均未得到证实。但已有研究证实细胞外囊泡内eNAMPT具有延缓衰老和延长小鼠寿命的作用。本研究利用CRISPRCas9技术对人脐带间充质干细胞系（hUCMSC）进行NAMPT基因修饰以达到对外泌体进行基因修饰的目的，为抗衰老后续研究提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述问题，提供一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，可以有效替代间充质干细胞成为具有抗衰老作用的新型药物。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：1）、针对人AAVS1位点设计sgRNA并构建sgRNA-CAG-hCas9载体；2）、将sgRNA-CAG-hCas9载体转染至293T细胞验证sgRNA切割效率；3）、构建含NAMPT基因、抗性基因neo、转录终止序列BGHpolyA、启动子EF-1A重组载体；4）、将步骤2）中切割效率好的sgRNA-CAG-hCas9载体与步骤3）中构建的重组载体共转染间充质干细胞，新霉素药物G418筛选得到稳转细胞系；5）、收集高表达NAMPT稳转细胞系培养基，利用外泌体试剂盒提取，得到高表达NAMPT基因的人脐带间充质干细胞外泌体。所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。步骤1）中，基因敲入位点为人AAVS1位点，该位点是能确保插入靶基因正常转录且不影响邻近基因表达的“安全港”位点。步骤2）中，切割效率高的sgRNA具体序列为SEQIDNO:2所示。、步骤3）中，构建的重组载体骨架为T-easy-vector-multi-5改造而来。步骤4）中，切割效率好的sgRNA-CAG-hCas9载体与步骤3）中构建的重组载体共转染间充质干细胞的比例为1：1。步骤4）中，新霉素药物G418筛选浓度为400µg/ml。所述间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，包括如下步骤：1）在人的AAVS1位点设计sgRNA并构建sgRNA/cas9质粒；2）转染至293T细胞内验证切割效率；3）构建含AAVS1位点的左同源臂LR、右同源臂RR、NAMPT基因、EF-1A启动子、neo、polyA等元件的载体质粒；4）将sgRNA/cas9质粒与含NAMPT基因的载体质粒共转染至间充质干细胞；5）G-418筛选得到单克隆间充质干细胞株。6）收集上清，提取外泌体。AAVS1位点是一个能确保插入靶基因正常转录且不影响邻近基因表达的“安全港”位点。通过本专利技术，较于慢病毒构建方法更加安全。附图说明图1为T7内切酶验证sgRNA切割效率结果；图2为NAMPT基因敲入后间充质干细胞NAMPT基因mRNA表达水平上调；图3为NAMPT基因敲入后间充质干细胞基因组鉴定；图4为NAMPT基因敲入后间充质干细胞外泌体内NAMPT蛋白表达量升高。具体实施方式实验仪器与试剂：RCP仪、离心机、37℃恒温培养箱、恒温摇床、倒置显微镜、CO2培养箱、超速离心机、凝胶成像仪、酶标仪；切胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、xfect转染试剂、外泌体提取试剂盒、MEM培养基、FBS、PBEF抗体、CD81抗体、GAPDH抗体、RIPA裂解液、鲑精蛋白、BCA试剂盒、CCK-8试剂盒。下面结合具体实施例子，对本专利技术的技术方案详细描述。实施例1、AAVS1位点sgRNA切割效率验证；1.sgRNA-CAG-hCas9载体构建；利用https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/网址在线设计sgRNA并合成正反义寡核苷酸序列，且将其进行退火反应后与Bbs1酶切后的sgRNA-CAG-hCas9质粒连接，鉴定，挑取阳性菌落。2.T7内切酶验证切割效率；将上述sgRNA-CAG-hCas9参考xfect转染试剂盒说明书转染至293T细胞内，72h收集细胞，提取基因组DNA，利用AAVS1-after-cut-F和AAVS1-after-cut-R引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化并进行退火处理，用T7内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。实施例2、AAVS1-NAMPT-NEO同源重组载体构建；骨架载体AAVS1-T-HDR-donor由扬州大学表观遗传学实验室提供，其上含有IRES、bGHpolyA、LOXP，左同源臂LR，右同源臂RR从人的基因组模板上扩增得到的，将AAVS1-T-HDR-donor、左同源臂LR、右同源臂RR及neo用ClonExpressMultiSOneStepCloningKit试剂盒进行连接，送测。将上述序列正确的质粒用EcoRV进行单酶切和启动子EF-1A、PolyA及3xFLAG-NAMPT-6His进行连接，送测，得到AAVS1-NAMPT-NEO同源重组载体。实施例3、获得AAVS1-NAMPT-NEO稳转细胞系及鉴定；将切割效率好的sgRNA-CAG-hCas9载体与AAVS1-NAMPT-NEO同源重组载体按照xfect说明书共转染间充质干细胞，400ug/mlG418筛选10天得到稳转细胞系。一部分细胞提取基因组，PCR扩增验证。一部分细胞用于提取总RNA并反转录合成cDNA，再用荧光定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：/n1）、针对人AAVS1位点设计sgRNA并构建sgRNA-CAG-hCas9载体；/n2）、将sgRNA-CAG-hCas9载体转染至293T细胞验证sgRNA切割效率；/n3）、构建含NAMPT基因、抗性基因neo、转录终止序列BGH polyA、启动子EF-1A重组载体；/n4）、将步骤2）中切割效率好的sgRNA-CAG-hCas9载体与步骤3）中构建的重组载体共转染间充质干细胞，新霉素药物G418筛选得到稳转细胞系；/n5）、收集高表达NAMPT稳转细胞系培养基，利用外泌体试剂盒提取，得到高表达NAMPT基因的人脐带间充质干细胞外泌体。/n

【技术特征摘要】
1.一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
1）、针对人AAVS1位点设计sgRNA并构建sgRNA-CAG-hCas9载体；
2）、将sgRNA-CAG-hCas9载体转染至293T细胞验证sgRNA切割效率；
3）、构建含NAMPT基因、抗性基因neo、转录终止序列BGHpolyA、启动子EF-1A重组载体；
4）、将步骤2）中切割效率好的sgRNA-CAG-hCas9载体与步骤3）中构建的重组载体共转染间充质干细胞，新霉素药物G418筛选得到稳转细胞系；
5）、收集高表达NAMPT稳转细胞系培养基，利用外泌体试剂盒提取，得到高表达NAMPT基因的人脐带间充质干细胞外泌体。


2.根据权利要求1所述的一种NAMPT基因修饰的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示：
atgaatcctgcggcagaagccgagttcaacatcctcctggccaccgactcctacaaggttactcactataaacaatatccacccaacacaagcaaagtttattcctactttgaatgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagtattttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggtaaagtagtaaccaaagagaaaatccaggaagccaaagatgtctacaaagaacatttccaagatgatgtctttaatgaaaagggatggaactacattcttgagaagtatgatgggcatcttccaatagaaataaaagctgttcctgagggctttgtcattcccagaggaaatgttctcttcacggtggaaaacacagatccagagtgttactggcttacaaattggattgagactattcttgttcagtcctggtatccaatcacagtggccacaaattctagagagcagaagaaaatattggccaaatatttgttagaaacttctggtaacttagatggtctggaatacaagttacatgattttggctacagaggagtctcttcccaagagactgctggcataggagcatctgctcacttggttaacttcaaaggaacagatacagtagcaggacttgctctaattaaaaaatattatggaacgaaagatcctgttccaggctattctgttccagcagcagaacacagtaccataacagcttgggggaaagaccatgaaaaagatgcttttgaacatattgtaacacagttttcatcagtgcctgtatctgtggtcagcgatagctatgacatttataatg...

【专利技术属性】
技术研发人员：周琦琦，崔恒宓，刘洋洋，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32