基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途制造技术

本发明专利技术涉及基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途。本发明专利技术通过采用CRISPR技术将脂肪间充质干细胞中的γ分泌酶进行敲除后，再使用特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体进行特异性的分化诱导，获得了胰岛样细胞，通过鼠实验证实了所述胰岛样细胞具有较好的降低血糖的效果。

【技术实现步骤摘要】
基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途
本申请涉及生物领域。更具体的，涉及一种基因编辑的干细胞在治疗疾病中的用途。
技术介绍
糖尿病主要由因遗传、环境、精神等因素相互作用而导致胰岛素相对或绝对缺乏，并以持续高血糖为其主要生化特征的一种慢性全身性代谢疾病，胰岛素的注射与药物治疗成为了当前临床上控制糖尿病和降低其并发症发生的主要方法，但是不能从根本上治愈糖尿病。研究证实，体外实验中胰岛细胞的移植能够有效降低血糖和减少其并发症的发生。由于干细胞能自我更新、增殖且具有多向分化潜能，因此干细胞移植成为一种更为理想的细胞替代疗法用于1型糖尿病的治疗。MSCs具有干细胞的共性：自我更新、多向分化及归巢能力。实验中在特定的诱导条件下，MSCs能够向多种组织或细胞分化，其可塑性较强。体外MSCs在诱导过程中首先分化为胰腺祖细胞或干细胞，其次才分化为具有分泌功能的胰岛样细胞，在诱导成功的细胞中检测到干细胞或祖细胞和成熟的胰岛细胞共存目前国内外研究证实，胰岛素分泌细胞可以由干细胞诱导分化而来。诱导的条件不同，骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化的细胞也不同。最近研究表明，BM-MSCs诱导分化为胰岛样细胞治疗糖尿病潜力巨大；特定诱导条件下BM-MSCs可以向多种组织细胞分化。试验中将人BM-MSCs通过特定诱导剂诱导分化后植入体内可控制血糖和改善机体免疫状态，同时可延缓其并发症的发生，且与糖尿病血管病变及视网膜病变密切相关。MSCs向胰岛样细胞诱导分化的方法有很多种，化学诱导法化学诱导法是目前最常用的方法，即通过化学试剂促进BM—MSCs分化成胰岛样分泌细胞。研究发现，MSCs在体外经药物诱导，或模拟体内胰岛细胞的微环境，能定向诱导分化为胰岛样细胞，并能表达出胰岛细胞的许多功能特性。诱导剂最常用的有细胞调节素、活化素A、尼克酰胺、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、B77、巯基乙醇等。Chen等分离出大鼠的MSCs，体外经过数次传代后，在含血清的DMEM中加入巯基乙醇和尼克酰胺预诱导24h，然后在不含血清的H-DMEM培养液中加入巯基乙醇和尼克酰胺10h，细胞形态发生变化，nestin蛋白及胰岛素量发生改变，将诱导后的细胞移植入糖尿病鼠体内，能够观察到糖尿病鼠胰腺中聚集着移植后的细胞，形态类似胰岛样细胞，通过检测发现有微量胰岛素分泌，因而能控制糖尿病鼠的血糖。由此证明MSCs通过诱导可以分化为能够分泌胰岛素的细胞，且能降低糖尿病鼠的血糖。尽管MSC的免疫调节作用目前研究的尚不清楚，但是其广泛的来源、低免疫原性以及免疫应答的效果使其成为治疗严重的顽固性自身免疫病最有前景的工具。虽然，大量研究表明，多种组织来源的MSC都可以诱导分化为IPCs，但是仍有许多关键的问题有待于进一步研究，例如，如何控制MSC的生长和分化，怎样提高MSC的诱导分化效率，诱导其分化后细胞表面抗原如何变化，以及长期培养后细胞有无恶变的倾向，移植后的长期作用效果等。此外，分化后的细胞在体内的作用机制也需要进一步的研究和解决。基因编辑技术是指用可编程的核酸酶识别基因组特定位点并介导DNA双链断裂，随后诱发DNA非同源末端连接(non-homologyend-joining，NHEJ)或同源重组修复(homologydirectedrepair，HDR)等机制，从而实现对DNA序列的定点修饰，包括靶向敲除或敲入基因。近年来建立的成簇规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)/Cas系统，具有效率高、操作简单、易于改造优化等优势，目前已经成为最重要的基因编辑工具，并被广泛应用于基因表达调控、细胞成像、核酸标记、表观遗传修饰、疾病治疗、功能基因筛选等领域。但是，目前采用CRISPR针对脂肪间充质干细胞的编辑后用于提高向胰岛样细胞的分化研究还比较少。
技术实现思路
本专利技术涉及提高脂肪间充质干细胞的诱导为胰岛样细胞的方法。更具体的，本申请涉及一种γ分泌酶敲除的脂肪间充质干细胞的制备方法。所述方法为采用CRISPR技术进行敲除。具体的，CRISPR靶标为：acctgggcattcttagctgcgggsgRNA序列为：accugggcauucuuagcugcGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQIDNO：1)更进一步的，本专利技术还提供特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体。所述单克隆抗体是以γ-分泌酶的表位肽VELGQVALRTSLELWMHTDPVSQKNESVRNQVEDLLATLEK作为免疫原，通过常规的单抗制备方法制备获得。单克隆抗体细胞株分泌的抗体为IgG1，轻链为Lambda链。轻链可变区(SEQIDNO：2)，重链可变区(SEQIDNO：3)。本专利技术进一步的，提供一种将转基因脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括(1)制备基因敲除的脂肪间充质干细胞；所述敲除采用CRISPR方法，具体的sgRNA序列如SEQIDNO：1所示；(2)步骤(1)制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞培养融合至80％-90％时用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d；其中单抗的轻链可变区序列如SEQIDNO：2所示，重链可变区序列如SEQIDNO：3所示。一种胰岛样细胞，其特征在于采用前述将转基因脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法制备得到。一种药物组合物，其特征在于含有前述所示的胰岛样细胞。前述所述的胰岛样细胞在制备用于糖尿病治疗的药物组合物中的用途。具体的，胰岛样细胞的治疗细胞数量1×109个-1×1011个/kg。进一步的，所述药物组合物中还含有第二治疗药剂。进一步的，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。有益效果本专利技术通过采用CRISPR技术将脂肪间充质干细胞中的γ分泌酶进行敲除后，再使用特异性针对γ分泌酶的单克隆抗体进行特异性的分化诱导，获得了胰岛样细胞，通过鼠实验证实了所述胰岛样细胞具有较好的降低血糖的效果。附图说明图1质粒pTrcHis2B图谱图2单克隆抗体亚型结果图图3Western印迹法检测胰岛细胞相关标记物的蛋白表达结果图图4治疗后空腹血糖水平结果图具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括(1)制备基因敲除的脂肪间充质干细胞；所述敲除采用CRISPR方法，具体的sgRNA序列如SEQ ID NO：1所示；(2)步骤(1)制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞培养融合至80％-90％后用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，单抗50μg/L，1％胰岛素-转铁蛋白-硒的10％FBS的DMEM，继续诱导10d，共诱导20d；其中单抗的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种将脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞的方法，所述方法包括(1)制备基因敲除的脂肪间充质干细胞；所述敲除采用CRISPR方法，具体的sgRNA序列如SEQIDNO：1所示；(2)步骤(1)制备的基因敲除的脂肪间充质干细胞培养融合至80％-90％后用组成为100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L活化素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，单抗50μg/L的10％FBS的DMEM培养液诱导培养10d，每2d半量换液一次；然后培养基换成组成为10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，单抗50μg/L，1％胰岛素-转...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨骏，朱成光，
申请(专利权)人：洛阳轩智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41