表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法技术

本发明专利技术提供了一种表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法，基于表皮干细胞作为基础，通过添加活性诱导肽，使得细胞分化成为胰腺细胞，并且分化时间较短，表皮干细胞来源宽泛，成本低廉，制备简便，具有极好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
本专利技术涉及非胚胎多能干细胞领域，具体地涉及非胚胎多能干细胞提供胰腺细胞的用途以及产生和使用它们的方法。
技术介绍
胚胎干细胞是一种全能干细胞，在适当的条件下它可分化为体内任何组织的体细胞。Lumelsky等人报道，通过体外五步诱导的方法，可将胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞，而Shi等在他们的研究中报道，他们通过三步法可将胚胎干细胞诱导成为胰岛β细胞，并且这些细胞移植入糖尿病老鼠体内后可使动物的体重增加，存活时间延长，血糖下降。但是，由于胚胎干细胞存在目前尚无法解决的致瘤性问题，因此目前离临床运用还有一定的距离。对于胰腺腺管来源的干细胞，Bonner-Weir等在他们的研究报告中报道，在胰腺的腺管中存在一种CK19阳性的干细胞，此种细胞在有KGF和Matrigel存在的情况下，可大量扩增并分化为胰岛β细胞。对于胰岛来源的干细胞，Zulewski等报道，他们从正常胰腺的胰岛团中分离培养出了一种表达神经干细胞标志nestin蛋白(巢蛋白)的细胞，此种细胞可在体外大量扩增，并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化为胰腺内分泌细胞。Huang&amp；Tang，2003；Zulewskietal.，2001文章中披露的胰腺干细胞为胰岛来源的成体干细胞。Zulewski等所用的组织为正常的人或鼠的胰腺组织。由于在实践中难以获得足够数量的正常的人胰腺组织，所以将该技术应用于临床时仍会面临来源不足的问题。在现有技术中，还有其他的方式来获得胰腺细胞。比如CN101310012A中提供将非胚胎多能干细胞向胰腺谱系分化的方法。本专利技术进一步提供非胚胎多能干细胞及其衍生的子代，从而为受试者提供胰腺细胞。所述方法包含将表达Ngn3的细胞与烟酰胺或exendiM两者中的一种或与这两者相接触以产生表达胰岛素的细胞，所述表达Ngn3的细胞已经通过下述过程制备：(1)将表达Oct-4和端粒酶且可以分化成外胚层、内胚层和中胚层细胞类型的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖细胞与一种第一试剂和一种第二试剂相接触以产生Pdx-I表达升高的细胞，其中所述第一试剂是激活素A，所述第二试剂抑制音猬因子(SHH)活性；以及(2)将Pdx-I表达升高的细胞与EGF和/或HGF相接触，以产生Ngn3表达升高的细胞。但是该方法制备复杂，成功率还有待进一步的提高。CN1847394A中公开了一种诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法，该方法是依次利用ActivinA和顺式视黄酸处理由胚胎干细胞形成的胚胎小体，使其分化得到胰腺细胞。但是该方法中使用了胚胎干细胞，由于胚胎干细胞来源有限，并不适应大规模推广使用，市场应用价值不高。因此，需要解决胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题，还需要寻找一种来源广泛的干细胞，并且采用简单诱导方式即可获得胰腺细胞来满足社会的需求，从而造福人类。
技术实现思路
本专利技术提供了与现有技术方案相比，将来源更为简便的表皮干细胞以更短的时间量(7天)和显著增加的产率(高达97％产率)分化成确定的胰腺细胞的改进方法。本文提供了使表皮干细胞分化为的胰腺细胞的方法，该方法包括步骤：第一步，将表皮干细胞放至1％Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导：两小时后，表皮干细胞开始铺展，此时将培养基换为含有10％胎牛血清和100ng/mlactivinA(Sigma)的DMEM培养基中培养24小时，然后表皮干细胞转为用含10％胎牛血清以及1-10mg/L活性刺激肽的DMEM培养6-8小时使表皮干细胞分化。之后，分化表皮干细胞接着用含有10％胎牛血清和1×10-6mol/LRA(Sigma)的DMEM培养基继续诱导24小时，得到胰腺前体细胞。第二步，胰岛前体细胞的扩增。分化的表皮干细胞用含有10％胎牛血清和10ng/mlbFGF(Sigma)的DMEM培养3-5天，诱导来源于表皮干细胞的胰腺前体细胞的扩增。在此期间，大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构。第三步，胰腺β细胞(Pancreaticβcell)的成熟。细胞转入含有N2和B27(Gibco-BRL)血清替代物(来自Gibco-BRL公司，照说明配制)，1ug/mlLaminin(Sigma)，10ng/mlbFGF以及10mmol/Lnicotinamide(Sigma)的DMEM/F12培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天，促进胰岛β细胞成熟，得到成熟胰腺β细胞。所述ActivinA的浓度可为50-300ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度为1×10-7-1×10-5mol/L培养基；所述ActivinA的浓度优选为100ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度优选为1×10-6mol/L培养基。所述Matrigel的质量百分含量为1％。所述bFGF的浓度为8-12ng/ml；优选为10ng/ml。将扩增得到的胰腺前体细胞用添加N2、B27血清替代物，层粘连蛋白(laminin)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺(nicotinamide)的培养基培养3-5天，得到成熟的胰岛β细胞。本专利技术另外一方面最重要的是提供一种活性刺激肽，所述活性刺激肽能够特异性的针对表皮干细胞中的胰岛素表达相关基因产生诱导趋势，能够显著的增加表皮干细胞的分化速度和分化能力，增强其向胰腺细胞的分化能力。本专利技术中涉及的活性刺激肽，其氨基酸序列分别如SEQIDNO：1-6任一所示。具体实施方式实施例1表皮干细胞的制备取(人)健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，制备表皮细胞和成纤维细胞。1.表皮细胞的分离：取2cm长、2mm左右宽的皮肤，以含抗菌素的PBS清洗3次；置蛋白酶液中，4℃消化16小时；取出皮肤，剥离表皮与真皮层；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中，37℃消化15分钟，终止消化，稍加吹打后过滤，收集细胞悬液，离心弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，调整细胞浓度至1×103/ml。2.滋养层细胞的制备：收集上述表皮与真皮层剥离后的真皮皮片，置于625U/ml胶原酶液中，消化后收集成纤维细胞悬液，将成纤维细胞培养至铺展80％左右，加丝裂霉素C至终浓度为10-6mol/L，37℃孵育12小时取出，用0.25％胰酶37℃消化5分钟，终止消化，离心5分钟(1000r/分钟)，弃上清，重悬细胞，备用。3.细胞外基质覆盖平皿的预备：在平皿内将上述表皮细胞培养至汇合13天；表皮细胞汇合后，吸去培养液，用无菌PBS清洗；加入乙二胺四乙酸(10mmol/L)和三羟甲基氨基甲烷盐酸(25mmol/L)和曲拉通(1％(w/v))混合液，37℃孵育(30分钟)至镜下可见细胞裂解；用PBS清洗；再加入0.5mg/ml变性的牛血清白蛋白，置37℃孵育1小时，以封闭非特异性粘附；PBS清洗，加入无血清培养液，置37本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活性刺激肽，其用于刺激细胞分化。/n

【技术特征摘要】
1.一种活性刺激肽，其用于刺激细胞分化。


2.一种活性刺激肽，其序列如SEQIDNO：3所示。


3.权利要求1-2任一项所述的活性刺激肽在用于促进表皮干细胞向胰腺细胞分化中的应用。


4.一种表皮干细胞向胰腺细胞分化的方法，具体包括以下步骤：
第一步，将表皮干细胞放至1％Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导：
两小时后，表皮干细胞开始铺展，此时将培养基换为含有10％胎牛血清和100ng/mlactivinA的DMEM培养基中培养24小时，然后表皮干细胞转为用含10％胎牛血清以及1-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨骏，张勇，
申请(专利权)人：洛阳轩智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41