利用转基因技术提高人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞效率的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用转基因技术提高人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞效率的方法。其包括将EEFSEC过表达载体构建成功，并转入干细胞。EEFSEC过表达载体能安全、有效地对干细胞进行EEFSEC基因修饰，不仅能够增加干细胞的活性，还能够提高角膜上皮细胞的分化效率，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
利用转基因技术提高人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞效率的方法
本专利技术涉及一种利用转基因技术提高人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞效率的方法。
技术介绍
干细胞，起源细胞，是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。此外，干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。干细胞的研究是继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域之一。1999年末，干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠；在2000年，干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来的，以研究干细胞增殖和分化机制的最终目的，即是应用干细胞治疗疾病。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。干细胞按照分化潜能大小大致可以分为三类：一.全能干细胞：全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能，可直接克隆人体，如受精卵、胚胎干细胞等。二.多能干细胞：多能干细胞具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，可直接复制各种脏器和修复组织，如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞。三.单能干细胞：单能干细胞，又称为专能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。2012年，我国的科研团队成功利用核移植和干细胞技术建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系，这些单倍体胚胎干细胞不仅具有典型的小鼠胚胎干细胞特征和发育潜能，同时还能够代替精子完成受精并产生健康可育的小鼠。这一成果不仅为获取遗传操作的动物模型提供了一种新的手段；同时也为哺乳动物生殖、遗传与发育调控机理研究提供了新的体系。孤雄单倍体胚胎干细胞和半半克隆小鼠的建立和获得途径。随着对干细胞研究的愈加深入，人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。而且随着科学技术水平的不断进步，干细胞研究的不断深入，相信断臂重生等科幻能力也将成为可能。角膜上皮损伤是指由于各种因素导致的角膜上皮屏障功能与完整性被破坏，引起角膜上皮细胞层部分或全层缺失的病理状态，重者可严重影响视功能。角膜上皮损伤的病因可分为先天性和后天性两大类，可以是局部因素或全身因素所致，如外伤、感染性损伤、泪膜功能异常、角膜神经功能异常、眼表炎性反应、眼睑或睑缘病变、角膜变性与内皮损伤、药物及其他配戴角膜接触镜者及全身代谢性疾病(如糖尿病)等。严重的角膜疾病需要通过手术的方法，去除病人混浊部分的角膜，用同样形状的健康透明的角膜来代替病变或损伤的角膜，以达到恢复视力或治疗角膜疾病的目的。现有技术中角膜移植主要有三种方式，传统角膜移植、自体缘移植和异体缘移植，其主要特点如下：1.传统角膜移植主要用于治疗各种原因引起的中央角膜混浊，其优点在于术后角膜光学区透明，缺点是仅为中央φ6-7mm光学区移植，对于干细胞缺失者无效，角膜很快再混浊，另外需要长期的免疫抑制治疗。自体缘移植的优点是不需要免疫抑制治疗，但健眼有发生干细胞缺失危险，且不能360°环状移植，效果受到一定的限制。异体缘移植是目前比较成熟的治疗干细胞缺失的手术方法，但供体材料极为有限，治疗机会非常少；有免疫排斥，术后用药至少一年，费用很高。随着干细胞技术的发展，近年来，人们提出了采用培养干细胞角膜进行移植的方法，如CORNEA2000；19(4)：421-42中公开了SchwabIR等的采用生物工程组织代替病变角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体或亲属的角膜皮膜，以保存人羊膜(HAM)为载体，传代后在HAM上分化培养细胞，滋养细胞为3T3，采用KGM培养基，无血清培养。这种方法的缺点是虽然在3T3滋养细胞上培养细胞可大量增殖，但因用鼠细胞作滋养细胞而有异源污染危险；另外在羊膜上分化培养使干细胞数量减少，无法保证长期有效性。现有技术中，针对角膜损伤治疗有很多方法，特别是采用干细胞对角膜进行治疗也有很多的形式。比如CN102952779A中公开了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，步骤如下：首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞。利用本专利技术的方法得到的角膜缘干细胞，经体外光学显微镜观察、电子显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞分析及克隆形成率测定等证实诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，并表现出良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上，可以作为种子细胞用于制备角膜移植物。CN1398644A中一种干细胞再生表层角膜，取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，剪碎后用含酶的消化液消化，终止消化后，离心制备单细胞悬液并用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入培养基在5％CO2、37℃条件下培养；培养细胞每2-3天换液一次，当细胞汇聚达80-90％时传代，第2-6代细胞直接传代至经过处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养8-20天后即得到可以作为移植治疗角膜疾病的材料的干细胞再生表层角膜。CN106167790A提供人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法，包括人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞以及人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞等步骤。本专利技术利用原代人角膜基质细胞培养上清液、人角膜内皮细胞培养上清液以及人晶状体细胞培养上清液作为条件培养基，通过向培养基中添加维甲酸和多种重组蛋白，结合三维培养和二维培养方法，模拟角膜内皮细胞发育进程诱导人胚胎干细胞定向诱导分化为人角膜内皮细胞，能够获得形态结构与正常人角膜内皮细胞相似的人角膜内皮细胞，体外传代培养结果显示其增殖能力与正常人角膜内皮细胞一致。CN102952777A公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5％CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。以上的方法虽然都可以转换为角膜细胞，但是转换的速度以及转换的成功率还有待提高。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种转基因的表皮干细胞的构建方法。该转基因的表皮干细胞可以促进表皮干细胞内基因的分化，能够促进向角膜上皮细胞的分化。具体的转基因的表皮干细胞的构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因的表皮干细胞，其特征在于：该转基因的表皮干细胞可以促进表皮干细胞内基因的分化，能够促进向角膜上皮细胞的分化。

【技术特征摘要】
1.一种转基因的表皮干细胞，其特征在于：该转基因的表皮干细胞可以促进表皮干细胞内基因的分化，能够促进向角膜上皮细胞的分化。2.一种基因工程化的干细胞的制备方法，包括以下步骤：S1.合成基因EEFSEC，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；S2.将基因EEFSEC插入表达载体，得到重组质粒；S3.将重组质粒转染人表皮干细胞，得到基因工程化的干细胞。优选地，表达载体为pIRESneo3载体。3.权利要求2方法制备得到的工程化的干细胞。4.一种人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化的方法，其特征在于：取权利要求3所述的干细胞在6孔板中进行细胞爬片，细胞种植密度控制在5-9X1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨骏，余兵生，
申请(专利权)人：洛阳轩智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41