一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种表达IL‑17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，将IL‑17A信号通路阻断剂靶向炎症部位，通过基因修饰使间充质干细胞特异表达IL‑17A信号通路阻断剂，特异性阻断IL‑17A与其受体的结合，从而调节人体免疫细胞功能，降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，进而达到治疗IL‑17A介导的自身免疫性疾病的目的。

Mesenchymal stem cells expressing interleukin-17A signaling pathway blocker

The present invention relates to a mesenchymal stem cell expressing interleukin 17A signaling pathway blocker. By utilizing the targeting effect of mesenchymal stem cells on inflammation site and the repairing ability of injury site, the interleukin 17A signaling pathway blocker is targeted to inflammation site. By gene modification, the mesenchymal stem cell expresses interleukin 17A signaling pathway blocker specifically and blockades the binding of interleukin 17A to its receptor. In order to regulate the function of human immune cells, reduce inflammation, repair damaged tissues and organs, and then achieve the goal of treatment of IL 17A-mediated autoimmune diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞
本专利技术属于干细胞领域，特别涉及表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞及其制备方法。
技术介绍
白细胞介素17(IL-17)是T辅助细胞17(Th17)活化产生的一种促炎症细胞因子，可直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白质，识别介导自身免疫和慢性感染的靶基因，因此在炎症反应、免疫调节、微生物与寄生虫感染方面起重要作用，在人细胞因子免疫调节网络中起关键调节作用。最新研究表明[1-2]，白细胞介素17A(IL-17A)作为促炎症因子IL-17家族的重要成员，与其膜表面受体IL-17RA结合后可激活效应细胞的NF-kB等炎症信号通路，从而引起下游一系列炎症因子(包括TNF-α、IL-1β及IL-6等)释放和炎症发生；IL-17A通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位，刺激前列腺素和金属蛋白酶产生，以及抑制蛋白多糖合成，同时IL-17A可进一步促进趋化因子CCL20、CXCL1、3、5、6、8及VEGF等分泌，进而导致免疫细胞异常分化、过度增殖和激活。IL-17A也可以通过降低细胞间黏附因子的表达从而破坏细胞屏障[1,3]。IL-17A受体包括5个成员：IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE[4]。IL-17RA是IL-17R家族中研究最多的分子，其编码基因位于22号染色体上，是由27个氨基酸残基的N-末端信号肽、287个氨基酸残基的胞外结构域、21个氨基酸残基的跨膜结构域和525个氨基酸残基的异常长的胞质尾巴构成的单程跨膜蛋白质[5]。IL-17RA广泛表达于多种组织器官，通过与IL-17A结合，诱导促炎细胞分泌趋化因子及炎性因子，参与组织重塑，参与急性期炎症反应。IL-17A具有强大的促炎作用，其与多种免疫类疾病如类风湿性关节炎、银屑病、慢性阻塞性肺炎等疾病密切相关。而最新开发的治疗自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、银屑病等)的新药中，Secukinumab、Brodalumab及Ixekizumab等单抗药物均针对IL-17A/IL-17RA信号通路而研发，通过阻断IL-17A与其受体的结合从而抑制人体关节或皮肤等组织器官的炎症反应，达到治疗类风湿关节炎或银屑病的目的[1,6-7]。间充质干细胞(MSCs)来源于发育早期中胚层，因其具有免疫调节及组织损伤修复双重功能，从而在自身免疫性疾病治疗中具有良好的临床应用前景。MSCs对炎症部位有较好的归巢和靶向作用，并通过分泌大量的可溶性细胞因子(如转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)等)从而抑制免疫细胞增殖、活化，抑制过激的淋巴细胞增殖和炎症因子释放，改善炎症局部微环境等[8-10]。同时，间充质干细胞对损伤组织具有较强修复能力，其具有定向分化为内皮细胞替换损伤皮肤的能力，同时可通过分泌表皮生长因子(EGF)、角蛋白生长因子(KGF)等因子促进皮肤组织的损伤修复[11-12]。本专利技术旨在利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，将IL-17A信号通路阻断剂靶向炎症部位，特异性阻断IL-17A与其受体的结合，从而调节人体免疫细胞功能，降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，进而达到治疗IL-17A介导的自身免疫性疾病的目的。
技术实现思路
针对上面的目标，专利技术人创造性地将间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力与IL-17A信号通路阻断剂的抗炎症作用结合起来，通过基因修饰使间充质干细胞特异表达IL-17A信号通路阻断剂。如前所述，IL-17A是一种促炎症细胞因子，其与受体结合后引起炎症反应，因此可通过阻断IL-17A与其受体的结合来抑制炎症反应。因此，本专利技术的第一方面提供了一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，其包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列，所述IL-17A信号通路阻断剂特异性阻断IL-17A与其受体的结合。本专利技术中，IL-17A受体选自IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE，优选IL-17RA。本专利技术中，“IL-17A信号通路阻断剂”是指任何能够特异性阻断IL-17A与其受体结合的物质，只要这种物质能够在间充质干细胞中特异性表达。例如，IL-17A信号通路阻断剂可以是IL-17A的类似物，通过竞争性结合IL-17A受体抑制IL-17A与其受体的结合。同样地，IL-17A信号通路阻断剂也可以是IL-17A受体(例如IL-17RA)的类似物，通过竞争性结合IL-17A抑制IL-17A与其受体的结合。在一个特定的实施方案中，本专利技术所述IL-17A信号通路阻断剂是能够与IL-17A或其受体特异性结合的抗体或其抗原结合片段。由于信号转导需要IL-17A与其受体的结合，利用特异性抗体与它们两者其中之一相结合即可阻断该信号转导的进行。各种类型的抗体及抗原结合片段均可用于本专利技术，只要它们能够特异性结合IL-17A或其受体，从而阻断两者的结合。在一个优选的实施方案中，所述IL-17A信号通路阻断剂是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白，长度为496个氨基酸残基，分子量约为60kD。其中，所述IL-17A单链抗体包含人IL-2信号肽(SEQIDNO：1)、IL-17A抗体的轻链可变区(VL，SEQIDNO：3)、接头(SEQIDNO：5)和IL-17A抗体的重链可变区(VH，SEQIDNO：7)四部分；所述IgG4的重链Fc片段包含人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区的CH3(SEQIDNO：9)和CH2(SEQIDNO：11)以及铰链区(SEQIDNO：13)三部分。所述IL-17A单链抗体的VL及VH两部分由接头序列链接，VL和VH的前后位置可更换，即：VL-接头-VH或VH-接头-VL。更优选地，所述外源核酸序列中编码人IL-2信号肽、IL-17A抗体轻链可变区(VL)、接头和IL-17A抗体重链可变区(VH)四部分的核苷酸序列分别如SEQIDNO：2、4、6和8所示，编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分的核苷酸序列分别如SEQIDNO：10、12和14所示。现有技术中已知多种载体系统可以将外源核酸序列导入目标细胞，它们普遍为本领域技术人员所知，也均可用于本专利技术。其中，特别适合本专利技术的是慢病毒载体系统，其能够将外源核酸序列整合到目标细胞的基因组DNA中，从而实现稳定的表达。在本专利技术的特定实施方案中，使用了第四代慢病毒载体系统LV-EGFP。由于不同组织来源的间充质干细胞在免疫调节和组织损伤修复中的作用并没有本质区别，因此，各种组织来源的间充质干细胞均可用于本专利技术，例如：来源于骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等。在一个特定的实施方案中，本专利技术使用了人脐带间充质干细胞。本专利技术的第二方面提供了制备上述表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：(1)构建包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列的慢病毒表达载体；(2)将步骤(1)得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达IL‑17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，其特征在于包含编码IL‑17A信号通路阻断剂的外源核酸序列，其中所述IL‑17A信号通路阻断剂可特异性阻断IL‑17A与其受体的结合。

【技术特征摘要】
1.一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，其特征在于包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列，其中所述IL-17A信号通路阻断剂可特异性阻断IL-17A与其受体的结合。2.权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述IL-17A受体选自IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE，优选IL-17RA。3.权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述IL-17A信号通路阻断剂是能够与IL-17A或其受体特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。4.权利要求3所述的间充质干细胞，其中所述IL-17A信号通路阻断剂是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白。5.权利要求4所述的间充质干细胞，其中所述IL-17A单链抗体包含序列为SEQIDNO：1的人IL-2信号肽、序列为SEQIDNO：3的IL-17A抗体轻链可变区(VL)、序列为SEQIDNO：5的接头和序列为SEQIDNO：7的IL-17A抗体重链可变区(VH)四部分。6.权利要求5所述的间充质干细胞，其中所述外源核酸序列中编码人IL-2信号肽、IL-17A抗体轻链可变区(VL)、接头和IL-17A抗体重链可变区(VH)四部分的核苷酸序列分别如SEQIDNO：2、4、6和8所示。7.权利要求4所述的间充质干细胞，其中所述IgG4的重链Fc片段包含序列分别为SEQIDNO：9、11、13的人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分。8.权利要求7所述的间充质干细胞，其中所述外源核酸序列中编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分的核苷酸序列分别如SEQIDNO：10、12和14所示。9.权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述外源核酸序列通过慢病毒载体导入所述间充质干细胞，优选地，使用LV-EGFP慢病毒载体系统。10.权利要求1-9任一项所述的间充质干细胞，为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。11.权利要求1-10任一项的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)构建包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列的慢病毒表达载体；(2)将步骤(1)得...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘拥军，刘广洋，张晨亮，李欣，王皓，米一，
申请(专利权)人：北京贝来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11