条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用技术

本发明专利技术具体涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系及其构建方法，包括：分别以pLX‑sgRNA‑EGFP载体为模板，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6‑Aqp11‑sgRNA片段；XhoI和NheI两个酶双酶切pLX‑sgRNA‑EGFP载体和hU6‑Aqp11‑sgRNA片段，得到pLX‑sgRNA‑EGFP载体骨架和hU6‑Aqp11‑sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒；pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11‑sgRNA‑EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。

Construction and application of conditional induced Aqp11 gene knockout cell lines in porcine trophoblastic cells

The invention specifically relates to a conditioned induction pig Aqp11 cell knockout cell line construction method and application. The conditional induced porcine trophoblast Aqp11 knockout cell line and its construction method include: amplifying the target sgRNA sequence of hU6 and Aqp11 by using pLX sgRNA sgRNA EGFP vector as template, hU6 and Aqp11 targeting sgRNA sequence as template, and SEQIDNo:3 and Aqp11 as overlapping leads to obtain overlapping fragments, and obtain two fragments. A sgRNA pLX EGFP vector and a hU6 Aqp11 Aqp11 sgRNA fragment were obtained. The pLX sgRNA sgRNA EGFP carrier skeleton and hU6 Aqp11 Aqp11 sgRNA adhesive terminal fragment were obtained. The recombinant plasmid was constructed and purified. The trophoblast cell line was constructed to obtain the conditional induced porcine trophoblast cell line Aqp11 knockout cell line.

【技术实现步骤摘要】
条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用
本专利技术属于基因工程
，更具体地，本专利技术涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。
技术介绍
规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-CAS9系统)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，作为第三代基因编辑技术，它能有效的识别特定的DNA序列，并在该特定位点进行切割，导致DNA双链断裂，在缺少特定模板的条件下，基因组修复依靠非同源重组末端连接，结果造成该基因的移码突变，导致基因表达破坏，相应蛋白功能的缺失，引起相应生物学的改变，成为基因功能研究及药物开发和疾病治疗潜在应用技术。水分占成年哺乳动物体重的65%以上，水分转运在动物新陈代谢和正常生命活动中发挥非常重要作用。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，主要参与转运水和小分子溶质（如甘油、尿素等），同时可能还参与一些气体（CO2、O2、NO和NH3）的转运。目前，在哺乳动物上已发现了13种水通道蛋白亚型（AQP0-AQP12），其中AQP11近年来被证实具有运输水分的功能且效率与AQP1相当。研究发现，Aqp11基因的缺失会提高小鼠发生早期肾脏病变的可能性，而Aqp11基因表达异常则会影响孕妇的羊水量，此外Aqp11在胚胎着床和早期发育过程中其表达量和定位会发生改变，这提示Aqp11基因可能在胚胎发育和疾病中发挥着重要作用。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。本专利技术条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，包括：分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。进一步地，所述pLX-sgRNA-EGFP质粒进行钝化，包括：步骤201，加入质粒体积的1/10体积的3M醋酸钠，混匀；步骤202，加入步骤201溶液体积的2.5倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；步骤203，4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用5-10倍体积预冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm离心10min，吸走上清；步骤205，真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。进一步地，所述包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：步骤301，293FT细胞铺板：提前一天在10cm2培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；步骤302，侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭质粒，各质粒使用量分别为3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL转染试剂，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；步骤303，用PBS清洗293FT细胞两次并加入5-8mL2-10%293FT细胞培养基，滴加混合液；步骤304，将上述293FT细胞放置37℃细胞培养箱培养，4-6h后弃去培养液，继续用2-10%293FT细胞培养基培养，37℃、5%CO2培养箱内培养；步骤305，经过48h后和经过72h后分别收集病毒液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。进一步地，所述慢病毒侵染包括：步骤401，复苏液氮保存的条件性表达Cas9的猪滋养层细胞，接种至卡式瓶内，用猪滋养层细胞培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；待细胞长至卡式瓶底面约60-80%时，准备进行病毒侵染；步骤402，将100-100μL过滤后的慢病毒液和5μL浓度为10μg/mL的Polyberen等加入到5mL猪滋养层细胞培养液中，混匀后加到步骤401中培养猪滋养层细胞的卡式瓶中，进行病毒侵染4-6h后换液；步骤403，24h后用滋养层细胞培养基替换病毒液继续培养；每天全量换液；步骤404，细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，冻存细胞，并进一步检测转基因的结果。进一步地，还包括：Aqp11基因敲除结果分析，所述结果分析方法包括：步骤501，采用添加Dox培养滋养层细胞，培养48-72h后，将其中一部分抽提基因组，并以基因组为模板，以设计敲除Aqp11基因两侧的引物进行扩增，扩增长度489bp，并经测序，进行初步分析，看是否测序结果是否有套峰出现；步骤502，将PCR产物进行分子克隆，分析基因敲除效率。主要步骤参照TAKARA公司TA试剂盒（pMD18-TVector，D101A）。步骤503，在PCR管中配制加入总体积为5μL的pMD18-T载体和PCR片段和水，然后将5µL的Solution加入上述溶液中；将PCR管置于恒温仪，16℃反应3h；步骤505，取100µL感受态细胞DH5α，冰上融解后，将上述的10μL载体连接产物加入，轻轻混匀后冰上放置30min；步骤506，42℃热激42-60s，迅速置于冰中放1-2min；步骤507，加入300µLLB培养基，37℃、150rpm培养1h；步骤508，取100µL菌液滴至有抗性氨苄的培养基平板上，并涂抹均匀，放入37℃中培养；步骤509，12h后，用移液枪头轻轻挑24个单克隆菌体并分别加至24管装有加入抗性氨苄的1mLLB培养基的离心管中，在摇床中固定好后，37℃、150rpm培养3h；然后使用M13上、下游引物，空载扩增长度为140bp，进行菌液PCR检测，将条带长度正确的剩余菌液送至生工测序，根据测序结果计算基因敲除效率。本专利技术上述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系应用，该SgRNA导向序列具有如SEQIDNo:1所示的碱基序列；所述敲除猪Aqp11基因的SgRNA导向序列在建立条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系中的应用。借由上述方案，本专利技术条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用至少具有以下优点：本专利技术以猪胎盘滋养层细胞为研究对象，结合运用CRISPR/Cas9系统，构建了通过强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导敲除Aqp11基因的猪胎盘滋养层细胞系。结果显示诱导后，猪胎盘滋养层细胞的基因组内Aqp11基因可以100%发生切割，Dox诱导前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，其特征在于，包括：分别以pLX‑sgRNA‑EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和

【技术特征摘要】
1.一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，其特征在于，包括：分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。2.根据权利要求1所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述pLX-sgRNA-EGFP质粒进行钝化，包括：步骤201，加入质粒体积的1/10体积的3M醋酸钠，混匀；步骤202，加入步骤201溶液体积的2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；步骤203，4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用5-10倍体积预冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm离心10min，吸走上清；步骤205，真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。3.根据权利要求2所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：步骤301，293FT细胞铺板：提前一天在10cm2培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；步骤302，侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭质粒，各质粒使用量分别为3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL转染试剂，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；步骤303，用PBS清洗293FT细胞两次并加入5-8mL2-10%293FT细胞培养基，滴加混合液；步骤304，将上述293FT细胞放置37℃细胞培养箱培养，4-6h后弃去培养液，继续用2-10%293FT细胞培养基培养，37℃、5%CO2培养箱内培养；步骤305，经过48h后和经过72h后分别收集病毒液，用慢速离心机以2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱翠，白银山，陈庄，蒋宗勇，叶金玲，陈子韬，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：广东,44