一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV‑IGF‑1重组质粒；S2.将S1所得pLV‑IGF‑1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞经过表达IGF‑1基因后，细胞增殖速度加快，并且细胞IGF‑1的表达量增加；将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF‑1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果。

A Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Overexpressing IGF-1 and Its Preparation and Application

The invention discloses an umbilical cord mesenchymal stem cell overexpressing IGF_1, a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: S1. inserting the target gene into the lentivirus system vector to construct a recombinant plasmid pLV IGF 1; S2. Co-transfecting the pLV IGF 1 recombinant plasmid obtained from S1 with the packaging plasmid to prepare lentivirus particles; S3. Transfecting the lentivirus particles obtained from S2 into umbilical cord mesenchymal stem cells, i.e., obtaining the genetically engineered umbilical cord interstitial cells overexpressing IGF 1. Mesenchymal stem cells. The umbilical cord mesenchymal stem cells express IGF * 1 gene, and the cell proliferation rate is accelerated. The expression of IGF * 1 is increased. The umbilical cord mesenchymal stem cells are injected into the brain of the brain injured miniature pig. The results show that the expression of IGF - 1 in the peripheral blood and brain tissue of the pigs is increased, which has a good therapeutic effect on brain injury.

【技术实现步骤摘要】
一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程与生物医学工程
，具体地，涉及一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
缺血性脑血管病(ischemiccerebrovasculardisease，ICVD)是指局部脑组织包括神经细胞和胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的病变、坏死或功能瞬态损耗。目前，缺血性脑血管疾病在全部脑血管病中約占80％，并且脑缺血疾病有着发生率高，死亡率高，复发率高，致残率高等特点。而我国是卒中高发的国家，每年新发脑卒中200万人，卒中死亡人数约250万人，年增长率达8.7％。临床上因大脑中动脉闭塞导致的缺血性脑血管病占绝大多数。目前，随着医疗水平和医疗服务条件的提高，特别是急救手段和治疗效果的提高，使得脑卒中患者的死亡率逐渐下降，而生存下来的脑卒中患者大约有75％的人遗留不同程序的致残，严重影响患者的日常生活活动能力和社交能力，给家庭和社会带来了巨大的负担，因此，研究脑缺血的治疗及康复，降低其死亡率和致残率，对提高患者的生活质量有着极大的意义。干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞，主要存在于胚胎、骨髓、外周血、脐带血等处，而血液(外周血、脐带血)中的干细胞，目前发现有造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)和间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)两种。脐带血中干细胞含量丰富，明显超过外周血含量。MSCs是混合细胞群，不具备典型的形态特征，其表达的表面标志抗原具有非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，目前没有找到MSCs的特异性抗原标记，鉴定MSCs主要是根据其形态、功能等。许多研究证明MSCs均标记为：SH2(+)、SH3(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD106(+)、CD120a(+)、CD124(+)、CD166(+)。MSCs在体外可分化为神经样细胞。如在脑源性神经营养性因子、碱性成纤维生长因子的诱导或脑组织细胞共培养，MSCs能分化为具有神经元和神经胶质细胞标志的细胞。脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞之一，其来源丰富、采集方便、安全、无伦理问题，且具有免疫调节作用等特点，决定了其在临床治疗方面具有很大的应用前景。目前干细胞的临床应用有两种方法：一是直接将脐带血间充质干细胞移植体内，通过体内的微环境诱导其为相应的细胞，发挥相应的作用；二是将脐带血间充质干细胞体外培养、定向诱导其分化为目的神经样细胞，然后通过一定的方法植入到体内，治疗相关神经系统疾病。脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞，具有多向分化潜能，在体外能够定向诱导分化为各种神经细胞，为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)是由70个氨基酸组成的单链碱性多肽分子，分子量约为7649Da。IGF-1来源于体内许多细胞，通过自分泌、旁分泌和内分泌机制并与IGF-1受体(IGF-1R)结合发挥多种生理作用。大量的动物实验证明，IGF-1具有神经营养作用，不仅对大脑生长、发育、髓鞘的形成有重要的作用，而且是潜在的有丝分裂源，能够在颅脑损伤时能起到很好的神经保护作用以及抗凋亡作用。因此，IGF-1将来有可能作为ICVD的一种神经治疗药物而应用于临床。但是，目前尚未见有将IGF-1作为外源基因对MSCs进行修饰，并用于治疗西藏小型猪脑损伤的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，所述脐带间充质干细胞由IGF-1基因修饰，通过过表达IGF-1刺激细胞增殖速度加快，进而治疗小型猪脑损伤。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法中所述的pLV-IGF-1重组质粒、慢病毒颗粒和/或过表达IGF-1的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供IGF-1基因作为mir-338基因作用的靶点在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV-IGF-1重组质粒；S2.将S1所得pLV-IGF-1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。本专利技术所述脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰后，细胞增殖速度加快，转染后的人脐带间充质干细胞用流式细胞仪检测，检测发现细胞表面抗原标志物CD90、CD105、CD146表达阳性，CD43、CD45表达阴性，处于未分化状态，并且转染后细胞IGF-1的表达量增加，转染后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形或椭圆形，以后逐渐变为多角形；此外，专利技术人构建了西藏小型猪介入梗阻模型，将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF-1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果。行为学结果显示：缺血缺氧模型组西藏小型猪出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走；干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰组在治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走。综上，表明本专利技术所述过表达IGF-1的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。优选地，所述慢病毒系统载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP_CD511B-1。优选地，所述宿主细胞为293T细胞。优选地，步骤S2中，所述慢病毒颗粒的MOI指数为10。优选地，步骤S3中，转染时间为4h。本专利技术还请求保护上述制备方法制备得到的基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。本专利技术还请求保护上述pLV-IGF-1重组质粒、慢病毒颗粒和/或过表达IGF-1的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。此外，本专利技术人还构建了过表达mir-338的重组质粒，发现过表达mir338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后细胞中IGF-1的表达量降低，说明mir338和IGF-1是负向调节关系。因此，进一步构建了沉默mir-338的重组质粒，发现沉默mir-338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后细胞中IGF-1的表达量增加，对脑损伤有较好的治疗效果。因此，本专利技术还请求保护IGF-1基因作为mir-338基因作用的靶点在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。优选地，所述制剂过表达IGF-1或沉默mir-338。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所提供的脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰后，细胞增殖速度加快，并且细胞IGF-1的表达量增加；将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF-1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的药物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV‑IGF‑1重组质粒；S2.将S1所得pLV‑IGF‑1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV-IGF-1重组质粒；S2.将S1所得pLV-IGF-1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述慢病毒系统载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP_CD511B-1。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳敏，田雨光，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44