一种功能增强的通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种同时抑制T细胞抗原受体(TCR)、主要组织相容性复合体(MHCⅠ)及免疫抑制分子相关基因的CAR‑T细胞及其制备方法。所述的CAR‑T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，且不表达TCR、MHCⅠ和免疫抑制分子PD1，不仅适用异种受体，具有通用性，同时具有更强的杀伤力。

A universal enhanced CAR-T cell and its preparation method and Application

The invention provides a CAR T cell which simultaneously inhibits T cell antigen receptor (TCR), major histocompatibility complex (MHC I) and immunosuppressive molecule related genes and a preparation method thereof. The CAR T cells express chimeric antigen receptor (CAR) and do not express TCR, MHC I and immunosuppressive molecule PD1. The CAR T cells are not only suitable for heterologous receptors, but also have stronger lethality.

【技术实现步骤摘要】
一种功能增强的通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途
本专利技术属于医药、生物细胞学和分子生物学领域，涉及免疫治疗领域。具体地，涉及采用PTG(PolycistronictRNA-gRNA)同时敲除T细胞的TCR、B2M和PD1基因，并引入嵌合抗原受体(CAR)，以获得功能增强的通用型CAR-T细胞。
技术介绍
近几年，肿瘤免疫治疗进入了快速发展阶段，CAR-T疗法作为其中一种重要的方法在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。目前，国内越来越的企业、医院及学术机构加入到这一研究领域中，共同推进CAR-T疗法的发展，探索更为广泛的潜在应用价值。目前，在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗领域，主要是采用自体的CAR-T细胞进行治疗，基本过程是采集患者自己的外周血，分离T细胞，并完成CAR-T细胞的制备和回输。因受限于免疫系统自身的某些限制性因素，如CAR-T异体回输时由于免疫原性等原因导致的免疫排斥、移植物抗宿主反应(GVHD)等，这将限制CAR-T细胞治疗技术广泛性和便捷性应用，同时也在一定程度上提高了该技术的成本，另外，对于婴儿患者、或者70岁以上的老年患者，或者一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者，其自体的T细胞的质量和数量达不到要求，是不适合制备CAR-T进行肿瘤治疗的。所以，通用型CAR-T技术将是今后的一个方向，在基因编辑技术如ZFN(zinc-fingernucleases)、TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和CRISPER-Cas9等的进步下，如果能够实现对健康供体来源的T细胞TCR及其他导致不同个体间免疫原性的基因的敲除，将会使CAR-T这一技术真正成为一种活的药物，进而能够广泛而方便的供合适的患者使用，实现CAR-T细胞治疗的产业化，并极大地降低成本。目前，已研究出通用型的CAR-T(universal-CAR-T,uCAR-T)细胞。如Cellectis的UCART19也是一种同种异体CAR-T细胞疗法，基于Talen基因编辑TCR-α链的表达，不需要依据患者进行相应修饰，而是直接将来源于非患者(non-patient)供体的T细胞进行工程化，用于多个患者的治疗。通用型的CAR-T细胞也并非完美无缺，如存在供体隐匿性感染问题；基因的敲除并不能完全消除双相排斥作用；uCAR-T细胞库的数量、复苏和代次问题，对临床应用和治疗效果会有一定的影响；基因的“脱靶”效应可能会影响一些潜在的安全性问题。面对这些可能存在的问题，许中伟、黄晓军等人则没有采用基因编辑，而是采集患者的亲属的健康T细胞，该种方法无需细胞的冷冻复苏，无需抽患者血液，同时适度的GLV的存在也可以增强T细胞的杀伤力。T细胞(抗原)受体(Tcellreceptor,TCR)为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，分别由TRAC和TRBC基因表达。TCR敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是一组编码哺乳动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC也叫做HLA(humanleukocyteantigen,HLA)复合体。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC-I类、MHC-II类、MHC-III类基因，分别编码MHCI类分子、MHCII类分子、MHCIII类分子。MHC-I类分子的功能是递程非己蛋白的肽片段给细胞毒T细胞，然后立即触发机体的免疫反应以杀死外来入侵物质。而正常供体T细胞上也表达有MHC-I类分子，受体T细胞表面的TCR受体可识别正常供体T细胞上的MHC-I类分子进而将供体T细胞杀死。B2M分子是MHC-I类分子的组成部分，敲掉供体T细胞上的B2M基因可避免受体的TCR对供体T细胞上的MHC-I类分子的免疫反应。T细胞免疫抑制受体主要包含了PD1(程序性死亡分子-1)、CTLA-4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原4)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3),LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)和BTLA(B和T淋巴细胞弱化子)等。具体地，PD1分子一旦接触肿瘤细胞就会与PD-L1结合，而PD-L1会传递一种抑制信号给T细胞，抑制T细胞的活化和杀伤能力。CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，又名CD152)是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。TIM-3，LAG-3和BTLA也通过多种方式抑制T细胞的免疫应答。T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)后，其免疫抑制受体(PD1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3和BTLA等)表达升高。T细胞由于免疫抑制受体的存在，杀伤力有限，而敲除免疫抑制相关基因，可打破这种免疫抑制效应，增强CAR-T细胞功能。CAR-T细胞是目前过继免疫治疗令人振奋的成就之一，在临床治疗上取得了显著成功。目前，通常因为之前的化疗或造血干细胞移植而T细胞缺损，许多患者可能遇到疗效降低的情况。利用同种异体供体来源的T细胞发展通用型产品，用来提供给那些因淋巴细胞数量较低或质量较差(以及体外扩增能力低)而没有机会进行自体细胞输注的患者。同时，由于CAR-T疗法是针对每位患者进行个性化治疗，可能会产生昂贵的成本，因此价格高昂。在理想情况下，通用的现成的产品可抵消如今临床试验进行单个细胞制剂所需成本。因此，实现CAR-T细胞的异体治疗，增强其通用性和杀伤力是目前CAR-T细胞疗法亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通用型且杀伤力强的CAR-T细胞，以使更多患者获得更好的治疗效果。本专利技术的上述目的通过以下技术手段实现：一方面，本专利技术提供了一种功能增强的通用型CAR-T细胞，所述的CAR-T细胞中经过多基因敲除，同时抑制了T细胞抗原受体TCR，主要组织相容性复合体MHC和T细胞免疫抑制受体PD1在T细胞中的功能。其中，T细胞抗原受体TCR由TRAC和TRBC基因编码，编码所述主要组织相容性复合体的基因包括HLA-A，B2M和CIITA。作为一种优选的实施方式，所述的功能增强的通用型CAR-T细胞中同时敲除了T细胞抗原受体TCR的TRAC或TRBC基因，组织相容性复合体MHC的B2M基因，以及PD1基因。由于该细胞被敲除TCR，B2M和PD1基因，缺少免疫排斥反应，避免了输入同种异体的T细胞出现的GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰，从而实现异体治疗。同时，该细胞还缺少免疫抑制基因PD1，从而打破T细胞抑制信号，增强CAR-T细胞的杀伤力，进一步清除残留的肿瘤细胞。T细胞中，免疫抑制因子除了PD1，还有CTLA-4、TIM-3、LAG-3和BTLA等，这些免疫抑制因子的缺失都可以增强T细胞杀伤力。因此，作为优选的实施方式，本专利技术的CAR-T细胞可以缺少免疫基因CTLA-4、TIM-3、LAG-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种功能增强的通用型CAR‑T细胞，所述的CAR‑T细胞中经过多基因敲除，同时抑制了T细胞抗原受体TCR，主要组织相容性复合体MHC和T细胞免疫抑制受体PD1在T细胞中的功能。

【技术特征摘要】
1.一种功能增强的通用型CAR-T细胞，所述的CAR-T细胞中经过多基因敲除，同时抑制了T细胞抗原受体TCR，主要组织相容性复合体MHC和T细胞免疫抑制受体PD1在T细胞中的功能。2.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞，所述通用型CAR-T细胞中同时敲除了T细胞抗原受体TCR的TRAC或TRBC基因，组织相容性复合体MHC的B2M基因，以及PD1基因。3.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞，通过TALEN或锌指方法或CRISPR/Cas9系统的方法进行TCR、B2M和PD1基因的敲除获得通用型CAR-T细胞。4.根据权利要求3所述的通用型CAR-T细胞，通过CRISPR/Cas9系统的方法进行TCR、B2M和PD1基因的敲除获得通用型CAR-T细胞；优选地，采用SEQIDNO:1-SEQIDNO:4中的任意一条sgRNA敲除TCR基因；更优选地，采用SEQIDNO:4所示的sgRNA敲除TRBC基因；优选地，采用SEQIDNO:5-SEQIDNO:7中的任意一条sgRNA敲除TCR基因；更优选地，采用SEQIDNO:7所示的sgRNA敲除B2M基因；优选地，采用SEQIDNO:8-SEQIDNO:11中的任意一条sgRNA敲除敲除PD1基因；更优选地，采用SEQIDNO:11所示的sgRNA敲除PD1基因。5.根据权利要求3所述的通用型CAR-T细胞，采用SEQIDNO:15所示的PTG(PolycistronictRNA-gRNA)同时敲除TRBC，B2M，以及PD1基因。6.根据权利要求1-5任一所述的CAR-T细胞，所述的CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向分子选自以下群组：CD19、CD20、CD22、ROR1、BCMA、MUC-1、CLDN18.2、GPC3、CD174、HER2、GD2、CD33、CD38、CD138、CD123、CD30、EGFR、EGFRvIII、PSMA、Mesothelin、FAP、CEA、CD171、Glypican3、IL-13R、PSCA、CD123、CD133、CA125、EphA2、C-met、L1CAM、VEGFR、CS1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫文俊，罗敏，李光超，邱玉信，周兆，郭锦涛，丁雯，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44