间充质干细胞外泌体的制备方法技术

本发明专利技术涉及外泌体生产技术领域，具体而言，涉及一种间充质干细胞外泌体的制备方法。该制备方法包括：a)使用包含100μM～200μM的二甲基乙二酰甘氨酸的培养基培养间充质干细胞，以及b)从培养得到的所述间充质干细胞或其培养液上清中收集外泌体。本发明专利技术采用二甲基乙二酰甘氨酸处理间充质干细胞可获得更多的外泌体，且分泌的外泌体具有更好的组织修复能力。力。力。

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞外泌体的制备方法
[0001]本申请要求于2021年08月27日提交中国专利局、申请号为2021109974771专利技术名称为“间充质干细胞外泌体的制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术涉及外泌体生产
，具体而言，涉及一种间充质干细胞外泌体的制备方法。

技术介绍

[0003]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的典型细胞群体，广泛存在于人体各组织中，可来源于骨髓，皮肤，肺等多处器官组织。在体外和体内通过不同方式可诱导分化为脂肪组织细胞、软骨组织细胞、结缔组织细胞和骨组织细胞及神经干细胞等。间充质干细胞具有活跃的旁分泌功能，能通过外泌体分泌成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)等多种生长因子。
[0004]间充质干细胞外泌体(Mesenchymal stem cells exsome)是由间充质干细胞分泌的一类直径为30nm～150nm的膜性囊泡样小体，其不仅包含特征性蛋白标志物如TSG101，CD9，CD63和CD81等，而且可携带包括蛋白、脂质、微小RNA和长链非编码RNA在内的各种生物分子来传递功能性遗传信息。目前发现间充质干细胞是分泌外泌体能力最强的细胞，间充质干细胞外泌体能特异性表达间充质干细胞的相关分子如CD90、CD73等。间充质干细胞外泌体具有较低免疫源性，不会触发强烈免疫反应引发GVHD，因此广泛应用于疾病治疗、细胞治疗、再生医学等诸多领域。
[0005]但是，间充质干细胞外泌体的产量有限，即使大批量培养细胞也只能得到数量不多的外泌体；另外，在培养和提取过程需要大量人力物力财力，也大幅提高了外泌体生产制备成本，因此，如何优化间充质干细胞培养体系提高外泌体的产量至关重要。
[0006]研究表明，低氧对间充质干细胞外泌体产量和生理功能有着重要影响。一方面，低氧导致的细胞有氧代谢受阻可应激性刺激细胞外泌体生成和分泌；另一方面，低氧条件下，细胞HIF脯氨酸羟化酶(HIF
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PHD)活性被抑制，提高了低氧诱导因子HIF
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1胞内水平，促进了多种生长因子转录表达，进而使得缺氧诱导间充质干细胞分泌的外泌体具有独特功能。但目前常用物理方法剥夺氧气通常会造成细胞生长状态不佳、培养液pH改变等不利影响，而且实际操作中需要反复通排气，流程耗时且繁琐。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的第一目的在于提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：
[0009]a)使用包含100μM～200μM的二甲基乙二酰甘氨酸的培养基培养间充质干细胞，以及
[0010]b)从培养得到的所述间充质干细胞或其培养液上清中收集外泌体。
[0011]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养的气体条件为常氧条件、低氧条件或无氧条件。
[0012]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养基为低糖培养基。
[0013]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养基为低糖DMEM培养基。
[0014]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养基含有15％～25％(v/v)的FBS。
[0015]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养基不含外泌体。
[0016]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述培养于湿度饱和的条件下进行。
[0017]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，在培养时，每隔16～32小时更换新鲜的所述培养基。
[0018]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，步骤a)中的培养总时间为40～56小时。
[0019]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0020]可选的，如上所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，步骤b)中的收集外泌体外泌体的方法选自密度梯度离心、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀中的任一种，或其组合。
[0021]本专利技术的第二目的在于提供一种间充质干细胞培养基，其特征在于，包括培养基和其中添加的100μM～200μM的二甲基乙二酰甘氨酸；
[0022]所述培养基为如上所述培养基所定义。
[0023]本专利技术的第三目的在于提供如上所述方法制备得到的组合物。
[0024]本专利技术的第四目的在于提供一种药物，其包括如上所述的组合物及药学上可接受的载体。
[0025]本专利技术提供了一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，将传代稳定间充质干细胞(MSC)接种至细胞体外培养瓶，通过在培养液中加入低氧模拟药物二甲基乙二酰甘氨酸处理促进MSC细胞外泌体的释放。本专利技术采用药物处理间充质干细胞可获得更多的外泌体，且分泌的外泌体具有更好的组织修复能力。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术一个实施例中流式仪鉴定间充质干细胞；
[0028]图2为本专利技术一个实施例中低氧及DMOG药物处理间充质干细胞外泌体提取流程；
[0029]图3为本专利技术一个实施例中DLS检测低氧处理和DMOG处理MSC
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EXO颗粒差异；
[0030]图4为本专利技术一个实施例中透射电镜下DMOG MSC
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EXO外泌体呈茶托样形态；
[0031]图5为本专利技术一个实施例中低氧MSC
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EXO、DMOG MSC
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EXO对划痕愈合能力影响。
具体实施方式
[0032]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0033]除非另有说明，用于披露本专利技术的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本专利技术所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本专利技术的教导。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0034]本专利技术中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括：a)使用包含100μM～200μM的二甲基乙二酰甘氨酸的培养基培养间充质干细胞，以及b)从培养得到的所述间充质干细胞或其培养液上清中收集外泌体。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养的气体条件为常氧条件、低氧条件或无氧条件。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基为低糖培养基。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基为低糖DMEM培养基。5.根据权利要求1～4任一项所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基含有15％～25％(v/v)的FBS。6.根据权利要求5所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基不含外泌体。7.根据权利要求1～4、6任一项所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养于湿度饱和的条件下进行。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：李光超，王学俊，罗敏，陈雅南，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：