融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白，包括自N端至C端顺次连接的靶向CD19的嵌合抗原受体、连接子元件和CXCR5蛋白；所述嵌合抗原受体包括自N端至C端顺次连接的CD19抗体、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。本发明专利技术还公开了一种分离的核酸，其表达得到所述的融合蛋白。本发明专利技术还公开了一种含有所述核酸的载体。本发明专利技术还公开了一种T细胞。本发明专利技术还公开了包含所述的T细胞。本发明专利技术还公开了所述的T细胞在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]CD19是一种跨膜糖蛋白，对B淋巴细胞的活化与增殖过程起着重要的调节 作用，其广泛存在于超过95％的B细胞恶性肿瘤表面，主要包括急性B淋巴细 胞白血病、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤及B细胞非霍奇金淋巴瘤(弥 漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL、原发性纵隔B细胞淋巴瘤PMBCL以及滤泡性淋 巴瘤FL)等，而其在正常组织中的表达仅仅局限于B淋巴细胞谱系。
[0003]以CD19为靶点的CAR
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T细胞疗法凭借卓越的治疗效果开启了治疗难治复 发B细胞恶性肿瘤的新模式，公开资料显示，抗CD19 CAR
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T细胞治疗难治复 发B
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ALL的完全缓解率可高达70％
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90％。
[0004]近年来，抗CD19 CAR
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T治疗范围已逐渐由急、慢性B淋巴细胞白血病扩 展到具有较低侵袭性或偏惰性的B细胞淋巴瘤疾病治疗领域，如B
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NHL、边缘 区B淋巴瘤MZBL等。然而，类似的疗效未能在这些患者中成功复制，比如抗 CD19 CAR
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T治疗B
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NHL的完全缓解率目前仅有43％
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59％，抗CD19 CAR
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T药 物在治疗B细胞淋巴瘤时效果未及预期，亟需开发更有效的针对B细胞淋巴瘤 的CAR
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T治疗产品。
[0005]B细胞淋巴瘤是一类在组织形态、免疫表型、遗传生物学、临床治疗及预后 等各方面具有高度异质性的淋巴系统恶性肿瘤。不同于血液白血病，B细胞淋巴 瘤通常会在原位或转移灶处形成肿状物并在周围形成类似于实体瘤的肿瘤微环 境，抑制和阻挡CAR
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T细胞向肿瘤部位的迁移。因此，将CAR
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T细胞成功转 移到淋巴瘤部位使其更好发挥药物疗效成为CAR
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T治疗B细胞淋巴瘤时需要首 先解决的问题。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种融合蛋白及其应用，其能够将CAR
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T细胞高效转 移到B细胞淋巴瘤部位，使其更好发挥药物疗效。
[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种融合蛋白，包括自N端至C端顺次连接的 靶向CD19的嵌合抗原受体、连接子元件和CXCR5蛋白；
[0008]所述嵌合抗原受体包括自N端至C端顺次连接的CD19抗体、跨膜结构域、 共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
[0009]本专利技术的第二目的在于提供一种分离的核酸，其表达得到所述的融合蛋白。
[0010]本专利技术的第三目的在于提供一种含有所述核酸的载体。
[0011]本专利技术的第四目的在于提供一种细胞，含有所述的核酸或所述的载体，或 细胞膜表面表达有所述的融合蛋白中的所述嵌合抗原受体和所述CXCR5蛋白。
[0012]本专利技术的第五目的在于提供药用组合物，包含所述的细胞。
[0013]本专利技术的第六目的在于提供所述的细胞在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药 物中
的应用。
[0014]本专利技术将CD19抗体特异性靶向B细胞和CXCR5专一趋向肿瘤分泌 CXCL13因子的特点结合起来，获得了高表达趋化因子受体CXCR5的抗CD19CAR
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T细胞，其可引导改造后的T细胞往趋化因子CXCL13高表达的B细胞淋 巴瘤区域定向迁移富集并杀伤肿瘤细胞，从而有望解决现有抗CD19 CAR
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T疗 法治疗B细胞淋巴瘤效果较差的问题，彻底杀灭肿瘤，提高CR率。
附图说明
[0015]图1为本专利技术一实施例的融合蛋白结果图；
[0016]图2为本专利技术一实施例的抗CD19
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CAR质粒示意图；
[0017]图3为本专利技术一实施例的抗CD19
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CXCR5 CAR质粒示意图；
[0018]图4为本专利技术一实施例的抗CD19
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CD28T&I
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CXCR5 CAR质粒示意图；
[0019]图5为本专利技术实施例1的ELISA检测anti CD19
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scFv同CD19抗原结合情 况，A和B图分别为线形图和柱形图；
[0020]图6为本专利技术实施例2的膜蛋白阵列验证抗体的非靶点结合的相互作用结 果图；
[0021]图7为本专利技术实施例3的anti
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CD19 scFv能特异性识别CD19阳性细胞系 结果图；
[0022]图8A为本专利技术实施例4的细胞迁移实验示意图；
[0023]图8B为本专利技术实施例4的CAR Ts细胞在不同浓度的重组人CXCL13趋 化作用下随时间变化迁移情况图；
[0024]图9A为本专利技术实施例5的抗CD19
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CXCR5
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CAR T(BG
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T19C)杀伤人正常细 胞IFN
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γ分泌情况图；
[0025]图9B为本专利技术实施例5的抗CD19
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CXCR5
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CAR T(BG
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T19C)杀伤人正常细 胞IL
‑
2分泌情况图；
[0026]图10A为本专利技术实施例6的ELISA检测抗CD19
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CXCR5
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CAR T细胞体外 杀伤肿瘤靶细胞K562
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CD19细胞能力图；
[0027]图10B为本专利技术实施例6的ELISA检测抗CD19
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CXCR5
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CAR T细胞体外 杀伤肿瘤靶细胞Raji细胞能力图；
[0028]图10C为本专利技术实施例6的ELISA检测抗CD19
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CXCR5
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CAR T细胞体外 杀伤肿瘤靶细胞CD19阴性细胞K562细胞能力图；
[0029]图11为本专利技术实施例7的动物实验设计示意图；
[0030]图12为本专利技术实施例7的活体成像显示荷瘤小鼠经CAR
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T治疗后体内肿 瘤生长情况图。
具体实施方式
[0031]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。 附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实 现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0032]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的技术 领域
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的 术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括自N端至C端顺次连接的靶向CD19的嵌合抗原受体、连接子元件和CXCR5蛋白；所述嵌合抗原受体包括自N端至C端顺次连接的CD19抗体、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD19抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述CXCR5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子元件选自T2A、P2A、E2A、F2A和IRES中的一种，或T2A、P2A、E2A、F2A与IRES至少两者的任何组合中的任一种；优选T2A，且氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构域包含源自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域:CD8、CD28、4
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1BB、CD4、CD27、CD7、PD
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l、TRAC、TRBC、CD3ε、CD3ζ、CTLA
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4、LAG
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3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAPI0、CD2、NKG2C、LIGHT、DAPI2、CD40L、TIMl、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM；优选源自CD8蛋白的跨膜域，且氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述共刺激结构域包含源自下组中的一种或多种蛋白的共刺激结构域:CD28、4
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1BB、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM
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1、NKG2D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光超，罗敏，丁雯，王学俊，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：