含有猪瘟E2和圆环病毒的Cap的重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了含有猪瘟E2和圆环病毒的Cap的重组蛋白及其制备方法和应用，属于疫苗领域。本发明专利技术公开的疫苗活性成分为重组蛋白，所述重组蛋白由融合蛋白CSFVE2

【技术实现步骤摘要】
含有猪瘟E2和圆环病毒的Cap的重组蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于疫苗领域，具体涉及含有猪瘟E2和圆环病毒的Cap的重组蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。CSFV为有囊膜病毒，40
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60 nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123 kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基、分子量约438 kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，ORF两侧是5
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端非翻译区(5
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UTR)和3
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端非翻译区(3
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UTR)，且5
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端无帽子结构，3
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端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2
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3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS2
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3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是E0和E2，尤其是E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。
[0003]E2蛋白又称为gp55，为CSFV的囊膜糖蛋白，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。gp55常以2种形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面：一是形成100 kDa的同源二聚体，二是与gp33形成75 kDa的异源二聚体。在体外，E2可诱导产生病毒的中和抗体，在体内可诱导产生抗CSFV的攻击抗体。用E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100 LD50 CSFV Brescia毒株强毒的攻击。E2的蛋白骨架由371个氨基酸(ORF编码的690
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1060氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51～58 kDa。E2分子内的15个半胱氨酸(Cys)残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。
[0004]猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14
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25nm，平均直径17 nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA，由脱氧核糖核酸组成，在组织中的悬浮密度为1.37 cm3。猪圆环病毒2型(PCV
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2) 是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸病综合征（PRDC）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）的重要病原，还可引起多种肠炎病、仔猪先天性震颤（仔猪抖抖病）、母猪繁殖障碍等疾病，猪圆环病毒2型ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap)属于病毒保护性抗原，具有重要免疫功能。
[0005]用基因工程的方法制备猪瘟亚单位疫苗主要集中在E2这个抗原区域，E2抗原疫苗也是目前控制该病的重要途径之一。尽管目前市场上已有大肠杆菌和杆状病毒等表达猪瘟E2抗原和Cap基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的长效抗原疫苗的
制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是：如何改善猪瘟E2蛋白质在哺乳细胞中表达产物免疫效果差和/或如何克服猪瘟E2蛋白质在原核表达系统的表达产物免疫猪后使猪产生抗体时间短以及原核内毒素残留引起免疫死亡的缺陷。
[0007]为解决上述技术问题，第一个方面，本专利技术提供蛋白质，所述蛋白质由融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher和融合蛋白Cap
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SpyTag连接而成，所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher可为下述A1)
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A3)中任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述融合蛋白Cap
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SpyTag可为下述B1)
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B3)中任一种：B1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；B2)B1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0008]其中SpyTag与SpyCatcher能够重组，并自发形成异肽键偶联，从而将所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher和所述融合蛋白Cap
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SpyTag连接。
[0009]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0010]所述蛋白标签(protein
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tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
[0011]为解决上述技术问题，第二个方面，本专利技术提供与上述蛋白质相关的核酸分子，所述核酸分子由编码所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher 的核酸分子和编码所述融合蛋白Cap
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SpyTag的核酸分子组成，编码所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher的核酸分子可为下述g11)
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g13)中任一种，g11)编码链的编码序列是SEQ ID No.1 第5776
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7263位核苷酸所示的DNA分子；g12)编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质由融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher和融合蛋白Cap
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SpyTag连接而成，所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher为下述A1)
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A3)中任一种：A1) 氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；A2) A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；A3) 在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述融合蛋白Cap
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SpyTag为下述B1)
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B3)中任一种：B1) 氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；B2) B1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与猪瘟病毒疫苗相关的蛋白质；B3) 在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由编码所述融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher的核酸分子和编码所述融合蛋白Cap
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SpyTag的核酸分子组成，所述编码融合蛋白CSFVE2
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SpyCatcher的核酸分子为下述g11)
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g13)中任一种，g11) 编码链的编码序列是SEQ ID No.1第5776
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7266位核苷酸所示的DNA分子；g12) 编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5776
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7266位所示的DNA分子；g13) 与g11)或g12)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述融合蛋白CSFVE2

【专利技术属性】
技术研发人员：伏显华，
申请(专利权)人：北京中海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：