一种抑制成肌细胞殖增殖和分化的调控方法技术

本发明专利技术涉及一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，根据SMAD5基因CDS区域核苷酸序列全长，设计可靶向沉默SMAD5基因的siRNA，然后通过在线软件挑选可靶向沉默SMAD5基因效果最好的siRNA进行合成，合成的该siRNA命名为siSMAD5片段，其序列为：Sense：CCAUGGAUACAAGCAAUAATT；Antisense：UUAUUGCUUGUAUCCAUGGTT；用siSMAD5片段转染牛成肌细胞，成肌细胞增殖、分化的标志基因MyoG的mRNA水平显著下降，且成肌细胞肌管融合过程也明显受损。该方法简单快速准确，为今后开展调控肌细胞增殖、成肌分化过程提供了新的可靠研究方法。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制成肌细胞殖增殖和分化的调控方法
本专利技术属于分子生物学、细胞工程
，具体地涉及一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法。
技术介绍
骨骼肌是脊椎动物的的主要组织，其生长发育包括及细胞的增殖，分化，融合成为肌纤维等多个过程，揭示其调控机理是认识骨骼肌发育、畜禽产肉性状形成分子机制的基础。而在肌肉组织的生长发育过程中，肌卫星细胞的激活，增殖与分化等复杂的生理过程受多种激素和生长因子的调控。其中TGF-β信号通路是参与肌肉生长发育调控的重要信号通路之一，对成肌分化主要起抑制作用。SMAD家族作为TGF-β直接作用底物，在细胞的增殖与分化，胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着重要作用。然而，最新研究表明SMAD5基因可参与BMP信号通路对肌肉量起正向调控作用。研究发现，SMAD5基因不仅是存在于肌肉组织中，且在鼠上敲除SMAD1/5/8两周后，其肌肉量减少了约20％。逐渐增加的实验证明，SMAD5基因很有可能是肌肉发育的一个正向调控元件，而其在骨骼肌卫星细胞中的具体调控机制还不清楚。因此研究SMAD5基因对成肌细胞的增殖、分化过程具有重要的生理意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，其特征在于，该方法根据SMAD5基因CDS区域核苷酸序列全长，设计可靶向沉默SMAD5基因的siRNA，然后通过在线软件挑选可靶向沉默SMAD5基因效果最好的siRNA进行合成，合成的该siRNA命名为siSMAD5片段；其序列为：Sense：CCAUGGAUACAAGCAAUAATT；Antisense：UUAUUGCUUGUAUCCAUGGTT；用siSMAD5片段转染牛成肌细胞，成肌细胞增殖、分化的标志基因MyoG的mRNA水平显著下降，且成肌细胞肌管融合过程也明显受损。本专利技术的抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，简单快速准确，为今后开展调控肌细胞增殖、成肌分化过程提供了新的可靠研究方法。附图说明图1是qRT-PCR检测所合成siSMAD5片段的沉默效率；图2是qRT-PCR比较沉默SMAD5基因后细胞增殖过程相关标志基因mRNA水平表达量的变化；图3是Western-blot比较沉默SMAD5基因后细胞增殖过程相关标志基因蛋白表达情况；图4是成肌细胞肌管融合情况观察图及qRT-PCR比较沉默SMAD5基因后细胞分化过程相关标志基因mRNA水平表达量的变化；图5是成肌细胞融合分化时的肌管形成过程。下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施方式本专利技术的设计思路是，通过设计某一特定沉默基因用于抑制成肌细胞增殖和分化的过程，利用SMAD5基因的功能特性，在细胞中沉默该SMAD5基因功能，进而使SMAD5基因的细胞增殖、分化过程受阻。以下实施例涉及的载体、菌株、细胞、试剂来源如下：牛原代成肌细胞，为国家肉牛改良中心秦川牛背最长肌组织通过酶消化法分离获得。siRNA序列，由上海吉玛制药技术有限公司合成。引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)均购自Hyclone公司。LipofectamineTM3000转染试剂，购自Promega。PrimeScriptTMRTReagentKitwithDNAEraser反转录试剂盒、PrimixExTaqTMⅡ试剂盒均购自TaKaRa公司兔抗CDK1、CDK2多克隆抗体(一抗)购买于万类生物科技公司，兔抗β-actin多克隆抗体(一抗)及抗兔HRP(二抗)购自英国Abcam公司。其余Western-blot相关试剂均购自碧云天。本实施例给出一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，根据SMAD5基因CDS区域核苷酸序列全长，设计可靶向沉默SMAD5基因的siRNA，然后通过在线软件挑选靶向SMAD5基因效果最好的siRNA进行合成(由上海吉玛制药技术有限公司合成)，合成的该siRNA命名为siSMAD5片段，用siSMAD5片段转染牛成肌细胞，成肌细胞增殖、分化的标志基因MyoG的mRNA水平显著下降，且成肌细胞肌管融合过程也明显受损。SMAD5基因功能主要是由编码区的核酸序列决定，以GeneBank公布的SMAD5基因序列(NM_001077107.3)，该SMAD5基因的CDS区域核苷酸序列如下：ATGACGTCAATGGCCAGCTTGTTTTCTTTTACTAGTCCAGCAGTAAAACGATTGTTGGGCTGGAAGCAAGGTGATGAAGAGGAGAAATGGGCAGAAAAGGCAGTTGATGCTTTGGTGAAAAAACTAAAAAAGAAAAAAGGTGCCATGGAGGAACTGGAGAAAGCCTTGAGCAGTCCAGGACAGCCCAGCAAATGTGTCACTATCCCCAGATCTTTAGATGGACGCCTGCAGGTTTCTCACAGAAAAGGCTTACCCCACGTTATATACTGTCGTGTTTGGCGCTGGCCTGATCTGCAGAGTCATCATGAGCTAAAGCCATTGGATATTTGTGAATTTCCTTTTGGATCTAAGCAAAAAGAAGTTTGTATCAACCCATACCACTATAAGAGAGTGGAGAGTCCAGTCTTACCTCCAGTATTAGTGCCTCGTCATAATGAATTCAATCCACAACACAGCCTTCTGGTTCAGTTTAGAAACTTAAGCCACAATGAACCGCACATGCCACAAAATGCAACGTTTCCTGATTCTTTCCATCAGCCCAACAACACTCCTTTTCCCTTATCTCCAAATAGTCCCTACCCGCCTTCCCCTGCTAGCAGCACATATCCCAACTCCCCAGCAAGTTCTGGACCAGGAAGTCCATTTCAGCTCCCAGCTGATACTCCTCCTCCTGCCTATATGCCACCAGATGATCAGATGGGTCAAGATAATTCCCAGCCCATGGATACAAGCAATAATATGATTCCTCAGATTATGCCAAGTATATCCAGCAGAGATGTTCAGCCTGTCGCCTATGAAGAGCCCAAACATTGGTGTTCAATTGTCTATTATGAATTAAACAATCGTGTTGGGGAAGCTTTTCATGCATCTTCTACTAGTGTGTTAGTAGATGGATTCACAGACCCTTCGAATAACAAAAGTAGATTCTGCTTGGGATTGTTGTCAAATGTTAATCGTAATTCAACAATTGAAAACACTAGGCGACATATTGGAAAAGGTGTTCATCTGTACTATGTTGGTGGAGAGGTATATGCAGAGTGCCTCAGTGACAGCAGCATATTTGTTCAGAGTAGGAACTGCAACTTTCATCATGGCTTTCATCCTACCACTGTCTGTAAGATTCCCAGCAGCTGCAGCCTCAAAATTTTTAACAATCAGGAATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，其特征在于，该方法根据SMAD5基因CDS区域核苷酸序列全长，设计可靶向沉默SMAD5基因的siRNA，然后通过在线软件挑选可靶向沉默SMAD5基因效果最好的siRNA进行合成，合成的该siRNA命名为siSMAD5片段，其序列为：Sense：CCAUGGAUACAAGCAAUAATT；Antisense：UUAUUGCUUGUAUCCAUGGTT；用siSMAD5转染牛成肌细胞，成肌细胞增殖、分化的标志基因MyoG的mRNA水平显著下降，且成肌细胞肌管融合过程也明显受损。

【技术特征摘要】
1.一种抑制成肌细胞增殖和分化的调控方法，其特征在于，该方法根据SMAD5基因CDS区域核苷酸序列全长，设计可靶向沉默SMAD5基因的siRNA，然后通过在线软件挑选可靶向沉默SMAD5基因效果最好的siRNA进行合成，合成的该siRNA命名为siSMAD5片段，其序列为：Sense：CCAUGGAUACAAGCAAUAATT；Antisense：UUAUUGCUUGUAUCCAUGGTT；用siSMAD5转染牛成肌细胞，成肌细胞增殖、分化的标志基因MyoG的mRNA水平显著下降，且成肌细胞肌管融合过程也明显受损。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SMAD5基因CDS区域核苷酸序列如下：ATGACGTCAATGGCCAGCTTGTTTTCTTTTACTAGTCCAGCAGTAAAACGATTGTTGGGCTGGAAGCAAGGTGATGAAGAGGAGAAATGGGCAGAAAAGGCAGTTGATGCTTTGGTGAAAAAACTAAAAAAGAAAAAAGGTGCCATGGAGGAACTGGAGAAAGCCTTGAGCAGTCCAGGACAGCCCAGCAAATGTGTCACTATCCCCAGATCTTTAGATGGACGCCTGCAGGTTTCTCACAGAAAAGGCTTACCCCACGTTATATACTGTCGTGTTTGGCGCTGGCCTGATCTGCAGAGTCATCATGAGCTAAAGCCATTGGATATTTGTGAATTTCCTTTTGGATCTAAGCAAAAAGAAGTTTGTATCAACCCATACCACTATAAGAGAGTGGAGAGTCCAGTCTTACCTCCAGTATTAGTGCCTCGTCATAATGAATTCAATCCACAACACAGCCTTCTGGTTCAGTTTAGAAACTTAAGCCACAATGAACCGCACATGCCACAAAATGCAACGTTTCCTGATTCTTTCCATCAGCCCAACAACAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁越，昝林森，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61