高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法技术

本发明专利技术公开了高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法，涉及高密度长期培养CHO细胞生产抗VEGF人源化单克隆抗体的方法。步骤：(一)准备工作；(二)接种细胞；(三)细胞截留换液操作：第一阶段：细胞增殖阶段，该阶段的目的是促进细胞的快速增殖，在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段。第二阶段：抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段在该阶段。本发明专利技术有效实现在长期高密度培养CHO细胞过程中可以在线进行中空纤维柱的清洗，有效降低堵塞的发生，达到长期培养的目的。

【技术实现步骤摘要】
高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法
本专利技术涉及一种新型利用摇动式一次性袋式激流反应器及细胞截留装置进行高密度长期培养CHO细胞生产抗VEGF人源化单克隆抗体的方法。
技术介绍
近年来，随着对以哺乳动物细胞为载体所生产的如蛋白质类、生长因子、疫苗和单抗等重组生物制品的需求量不断加大，人们逐渐将目光集中于大规模动物细胞培养上，并且，随着对哺乳动物细胞了解的不断深入以及新技术的应用，细胞培养的水平在逐步的提高，从最初的几升到如今的几千升甚至上万升，蛋白表达量也由最初的几毫克每升到如今的几克甚至是几十克每升。但由于细胞体外培养的特性，重组生物制品结构的复杂性及对产品要求的一致性使得动物细胞培养技术很难被完全掌握，全球各大生物技术公司也在不断的探索如何提高重组生物制品的产量及质量，并取得了很大的进展。在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。当前灌注培养工艺主要还是依赖微载体作为基质来培养细胞，这就不可避免的需要使用血清来作为培养基的添加物来促进细胞的贴附，另外，载体的材质及数量等方面很大程度上制约了培养的细胞数量，其应用还具有一定的局限性。随着无血清悬浮培养工艺的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，如何不用微载体而将细胞截留在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。膜过滤细胞具有简单易行的特点，并且成本较低，但由于膜的表面积较小，容易堵塞成为膜过滤细胞的制约之处，因而，人们发现利用切向流技术进行过滤的手段可有效的提高膜过滤系统的效率并减少阻塞的发生，但阻塞问题仍无法彻底解决。对于利用切向流过滤悬浮细胞的工艺的重点在于如何进一步提高过滤效率而减少阻塞的发生上，本专利技术可实现表达抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞长期高密度培养生产抗体。
技术实现思路
本专利技术提供一种高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法。本专利技术为有效的实现表达抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞长期高密度培养，利用摇动式一次性袋式激流反应器作为细胞高密度培养装置，以中空纤维柱作为细胞截留装置，通过培养系统的相关管路设计，在中空纤维柱上增加反向冲洗管路，从而实现在长期高密度培养CHO细胞过程中可以在线进行中空纤维柱的清洗，有效降低堵塞的发生，达到长期培养的目的。为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法，按照如下工艺步骤：(一)准备工作：将反应器内注入无菌验证培养液，并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作，验证管路连接的完整性；将反应器模拟细胞培养条件运行1-2天进行无菌验证工作，验证通过后将验证用培养液弃掉即可；(二)接种细胞：将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养，在摇瓶中传2-3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养，当细胞数量达到接种要求时进行接种，接种后细胞密度一般为0.5×106-2×106个/mL，接种体积可以是反应器的最小培养体积，然后继续进行扩增培养至工作体积；接种后的细胞活率应该在90％以上，待细胞密度达到5×106-10×106个/mL时进行细胞截留换液操作；在进行细胞截留换液操作以前的细胞培养阶段可以视为种子细胞扩增期，控制培养参数为PH：6.8-7.2,之间；DO在30％-80％空气饱和度；温度为34℃-37℃；(三)细胞截留换液操作：该过程可分为两个阶段进行：第一阶段：细胞增殖阶段，该阶段的目的是促进细胞的快速增殖，在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段；在第一阶段细胞培养期间，进行细胞培养液置换速率应根据细胞的生长速度、营养物质的消耗情况进行，一般起始置换体积为20％-50％培养体积/天，然后缓慢增加，待细胞达到所需密度或增殖停止时换液速率稳定，一般培养液置换体积为80％培养体积每天；该阶段一般为接种后持续3-8天；第二阶段：抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段在该阶段，控制反应器培养参数：温度为36.5℃、PH为7.1-7.3、DO为60％-80％空气饱和度；同时，控制细胞密度的稳定；控制细胞密度的稳定通过以下方式操作：1)降低培养温度至32-35℃，同时抑制细胞增殖；2)或者，通过在灌注培养基内添加正丁酸钠抑制细胞增殖的化合物条件，正丁酸钠添加量为0.5-1mmol/L；3)或者，以通过从反应器内抽取一定量细胞培养液的方式少量弃去细胞以维持细胞密度的稳定；4)或者，通过以上两种或三种方式结合使用；在该阶段的细胞截留换液操作中，换液速率也应控制稳定，在培养液中适当添加促进表达的物质，该物质为0.2％糖基化位点添加剂、4-8mmol/L谷氨酰胺等物质。在该工艺中第(三)步骤细胞培养液置换过程在1个小时以内完成浓缩细胞及补充培养液的过程，在进行细胞培养液置换操作中应每隔5-20分钟进行一次反向冲洗操作，即停止悬浮细胞的截留浓缩操作，进行澄清培养液的由膜外向膜内的反向冲洗操作，操作过程一般为3-10分钟，然后继续进行悬浮细胞的截留浓缩过程，该过程结束后向反应器内补充新鲜培养基，同时对中空纤维柱再进行一次由膜外向膜内的反向冲洗过程，最后打开澄清培养基的循环管路，使中空纤维柱内部的培养液体始终处于流动状态以防止细胞碎片对膜的进一步堵塞。本研究的摇动式一次性袋式激流反应器其特征是：基于反应器的气体利用度高、低剪力、无搅拌桨利用流体动力学原理使CHO细胞悬浮培养的特性，另外在该反应器外部连接一个可与细胞截留装置相连的管路。本研究的中空纤维柱为可进行灭菌(可耐受湿热灭菌、γ射线灭菌、酒精浸泡或NaOH浸泡等)使用的符合GMP要求的材质制造的，该中空纤维柱通过一些外部管路(包括不锈钢管路及医用硅胶管路)与摇动式一次性袋式激流反应器相连。该系统可以单独进行灭菌后通过无菌连接装置与摇动式一次性袋式激流反应器相连。附图说明图1是带有反向冲洗结构的中空纤维柱悬浮细胞截留装置示意图；图中符号说明：铁架台1，中空纤维柱2，压力表3，连通阀4，蠕动泵5，细胞液流动方向6，丰收液流动方向7，培养基流动方向8。图2是表达抗VEGF人源化单克隆抗体细胞密度及活率曲线图。图3是细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体SDS-PAG电泳图。图4是细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体HPLC图谱。具体实施方式下面用最佳的实施例对本专利技术做详细的说明。实施例一高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法，其特征在于：按照如下工艺步骤：(一)准备工作：将准备好的摇动式一次性袋式激流反应器与细胞截留装置进行灭菌处理，使用无菌连接接头将两个装置连接，打开反应器与细胞截留装置连通管路的开关，使管路处于打开状态。将反应器内注入一定体积的无菌验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法，其特征在于：按照如下工艺步骤：(一)准备工作：将反应器内注入无菌验证培养液，并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作，验证管路连接的完整性；将反应器模拟细胞培养条件运行1‑2天进行无菌验证工作，验证通过后将验证用培养液弃掉即可；(二)接种细胞：将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养，在摇瓶中传2‑3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养，当细胞数量达到接种要求时进行接种，接种后细胞密度一般为0.5×10

【技术特征摘要】
1.高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法，其特征在于：按照如下工艺步骤：(一)准备工作：将反应器内注入无菌验证培养液，并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作，验证管路连接的完整性；将反应器模拟细胞培养条件运行1-2天进行无菌验证工作，验证通过后将验证用培养液弃掉即可；(二)接种细胞：将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养，在摇瓶中传2-3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养，当细胞数量达到接种要求时进行接种，接种后细胞密度一般为0.5×106-2×106个/mL，接种体积可以是反应器的最小培养体积，然后继续进行扩增培养至工作体积；接种后的细胞活率应该在90％以上，待细胞密度达到5×106-10×106个/mL时进行细胞截留换液操作；在进行细胞截留换液操作以前的细胞培养阶段可以视为种子细胞扩增期，控制培养参数为PH：6.8-7.2,之间；DO在30％-80％空气饱和度；温度为34℃-37℃；(三)细胞截留换液操作：该过程可分为两个阶段进行：第一阶段：细胞增殖阶段，该阶段的目的是促进细胞的快速增殖，在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段；在第一阶段细胞培养期间，进行细胞培养液置换速率应根据细胞的生长速度、营养物质的消耗情况进行，一般起始置换体积为20％-50％培养体积/天，然后缓慢增加，待细胞达到所需密度或增殖停止时换液速率稳定，一般培养液置换体积为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕中华，杨新春，张道旭，张雪亭，孟庆勇，姜媛媛，张磊，高红梅，王冰，安小丽，梁秋波，汪霖，张译文，刘姗姗，徐轶尔，
申请(专利权)人：哈药集团技术中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23