稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用。本发明专利技术提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2014189。本发明专利技术所提供的CHO细胞株K70E10-1D6能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，且制备获得的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，亲和力高达9.09×108L/mol，并能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用。
技术介绍
AGR2(Humananteriorgradient-2,HAG-2)，又名人前梯度蛋白，是一种蛋白质的二硫键异构酶。AGR2是首先在1998年由KuangW.等在表达雌激素受体的人乳腺癌细胞株中，通过比较筛选发现的一种生物学标记蛋白(KuangWW,ThompsonDA,HochRV,etc.Nucleicacidsresearch,1998,26(4):1116-1123)。同年由ThompsonA.和WeigelJ.通过分子生物学方法得到全长的cDNA克隆，比较后发现其与非洲爪蟾的前梯度蛋白(Xenopusanteriorgradient，XAG-2)同源，功能与蟾蜍的发育有关，并命名为AGR2(ThompsonDA,WeigelRJ.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,1998,251(1):111-116.)。虽然人类的AGR2蛋白是XAG-2的同源物，但是与XAG-2不同的是，人的AGR2蛋白主要分布在由内胚层分化出的气管、肺部、胃部、结肠等部位，因此AGR2在人的正常组织发育中起着某些作用。虽然AGR2在正常组织中有表达，并具有生理功能，但是在肿瘤细胞中AGR2是一个相对于正常细胞更高度表达的分泌蛋白，AGR2能扰乱正常细胞的生长，促进肿瘤的形成、生长与转移。因此，AGR2在肿瘤组织与正常组织中表达量存在差异，在正常细胞的生长、发育中起着重要的调节作用，也与肿瘤等疾病的发生、发展有密切关系。因此，AGR2是一个潜在的肿瘤治疗靶标。单克隆抗体在肿瘤治疗中具有特异性强，副作用小的特点。由于AGR2能促进肿瘤的形成、生长与转移，抗AGR2单克隆抗体能够与AGR2特异性地结合，从而达到抑制肿瘤形成、生长与转移的治疗性效果。在公开号CN101519649的专利中，公布了一种能够分泌鼠源抗AGR2单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A4及其制备方法。但是鼠源单克隆抗体具有较大的免疫原性，易产生不良反应。单克隆抗体经人源化改造后，能够解决以上问题。因此抗AGR2人源化单克隆抗体具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。CHO细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势。筛选稳定表达单克隆抗体的CHO细胞株，目前有多种方式报道，如共转染带有抗性的载体、转染营养缺陷性的细胞株、基于荧光的可视化筛选系统等。抗性筛选系统包括G418抗性、嘌呤霉素抗性等。绿色荧光蛋白作为可视化筛选系统的代表有着广泛的应用，如转染pEGFP载体(美国专利，No.5625048)可将目的基因与绿荧光蛋白EGFP融合表达，通过观察可以根据绿荧光的强弱有选择性的确定目的蛋白的表达高低。通过将抗性筛选系统和绿色荧光蛋白的可视化筛选系统整合，组合成筛选标签，则综合了两者的优势。但是，可视化筛选系统的不足在于，绿色荧光蛋白不是目标产物，可能影响目标蛋白的表达效率，同时绿色荧光蛋白也属于杂质，需要通过合适的方法予以去除。现有的去除绿色荧光蛋白的方法，如Cre重组酶系统等，需要在稳定细胞株上另外转染质粒，存在引入外源质粒的风险。能否不通过另外转染质粒，就达到除去细胞株中绿色荧光蛋白的目的，是可视化筛选系统急需解决的问题之一。综上所述，AGR2是潜在的肿瘤治疗靶标，抗AGR2人源化单克隆抗体解决了鼠源抗体免疫原性的问题，具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。抗AGR2人源化抗体的表达和制备成为需要突破的技术问题，也是抗AGR2人源化抗体成为候选抗肿瘤药物的必要条件。CHO细胞具有表达外源蛋白的优势，且易于大规模培养。抗性筛选系统与基于荧光的可视化筛选系统整合而成的筛选标签综合了两者的优势，有利于稳定细胞株的筛选。筛选完成后，需要解决不通过另外转染质粒而除去绿色荧光蛋白。因此，开发CHO细胞株能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体具有良好的应用前景和经济价值，并能解决上述技术问题。目前，现有技术中尚无能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株报道，也没有将CHO细胞株用于抗AGR2人源化单克隆抗体制备的应用报道。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株及其应用，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为：CCTCCNO：C2014189。该细胞株已于2014年10月10日在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武汉大学)注册保藏，保藏号为CCTCCNO：C2014189，名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6。本专利技术所述的CHO细胞株，能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，具体为该细胞株能够分泌表达抗AGR2人源化单克隆抗体到细胞培养上清液中，所分泌的抗体能够通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测。该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测，细胞培养上清液中抗体浓度保持在1-5mg/L。本专利技术所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，其宿主细胞为CHO-S细胞，带有绿色荧光和嘌呤霉素抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA片段creplasmid-free的方法删除；基因组中带有能够被确认的特征序列。具体来说，所述绿色荧光标签能够在荧光显微镜下显著地观察到；通过流式细胞仪的FITC-H通道检测，处于对数生长期的该细胞株的绿色荧光强度与宿主细胞CHO-S有显著的差异。通过转染序列为SEQNo.1的DNA片段creplasmid-free，能够除去该细胞株的绿色荧光蛋白。该细胞株基因组中带有的如SEQNo.2所示的特征序列能够用PCR法进行扩增，并用测序的方法予以确认。本专利技术第二方面提供所述细胞株在制备抗AGR2人源化单克隆抗体中的应用。本专利技术所述的CHO细胞株能够运用于抗AGR2人源化单克隆抗体的制备，使用无血清培养基长时间培养该细胞株，通过酶联免疫吸附法(ELISA)、HPLC检测，细胞培养上清液中抗体表达浓度可达10-100mg/L。使用亲和纯化的方式，能够从细胞培养上清液中纯化抗AGR2人源化单克隆抗体。本专利技术第三方面提供一种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2014189的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生。本专利技术所述的CHO细胞株K70E10-1D6制备的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与AGR2特异性结合，并能够被免疫印迹法(WesternBlot)检测，通过竞争性ELISA法检测，该抗体与AGR2的亲和力为9.09×108L/mol。本专利技术第四方面提供所述稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO‑S/K70E10‑1D6，所述细胞株的保藏号为：CCTCC NO：C2014189。

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/K70E10-1D6，所述细胞株的保藏号为：CCTCCNO：C2014189。2.如权利要求1所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CHO细胞株在制备抗AGR2人源化单克隆抗体中的应用。3.一种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2014189的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生。4.如权利要求3所述的一种抗AGR2人源化单克隆抗体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大伟，陈昊，郭昊，马少司，杲光伟，李东升，荣荣，武正华，李哲奇，朱奇，苏琪达，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31