本实用新型专利技术涉及一种快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸基于双抗体夹心的原理检测BBI，试纸含有支撑层、吸附层、保护层，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫；结合垫吸附有BBI的特异性抗体，纤维素膜设有用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的质控线，BBI的特异性抗体采用胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体。本实用新型专利技术的免疫层析试纸特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本技术涉及一种快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子 (Bowman-Brik trypsin inhibitor，BBI)的胶体金免疫层析试纸。
技术介绍
大豆蛋白质含量丰富，氨基酸组成平衡，且富含不饱和脂肪酸，是人体和动物体重 要的植物蛋白和植物油来源。由于其种植面积广，产量大，长久以来一直被广泛应用于食品 和饲料的加工原料，对于人类健康和动物营养具有极高的使用价值。然而，大豆中也含有多 种抗营养因子，这些抗营养因子在很大程度上影响了大豆的开发与利用。 大豆胰蛋白酶抑制因子（Soybean Trypsin Inhibitor，STI)是大豆主要抗营养 因子之一，STI大约有7~10种，但目前只有2种胰蛋白酶抑制因子的研究较为广泛，分别是 Kunitz胰蛋白酶抑制因子（KTI)和Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子（BBI)。Kunitz大豆胰 蛋白酶抑制因子主要对胰蛋白酶直接地、专一地起作用。而BBI含有大量的半胱氨酸，具有 两个独立的反应中心，同时具有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的能力。当食糜中胰蛋 白酶与BBI结合而减少时，肠促胰酶肽分泌也增加，这种双重刺激胰腺分泌，将会造成胰腺 分泌失调性肥大和增生，出现食物性消化吸收功能失调或紊乱，严重时出现头晕、恶心、腹 泻。因此，国内外研究人员对大豆胰蛋白酶抑制因子的失活方法进行了大量探索，但这些方 法并不能完全消除其影响。所以建立快速、准确的检测方法来检测食品及饲料中BBI的含 量显得尤为重要。 目前，已有一些利用BBI多克隆抗体或者单克隆抗体建立的ELISA方法能够对BBI 进行特异、灵敏的检测。而免疫层析试纸检测方法相对于ELISA方法更为快速，且具有成 本低、便携、易操作等优点，可用于大批量样品的定性与定量检测，在准确性和灵敏度上也 能够满足要求，该法分析过程简单，用作BBI的检测有独特优势，是需要优先发展的检测技 术。目前没有发现关于BBI免疫层析试纸检测方法的报道，所以该方法将会成为大豆胰蛋 白酶抑制因子检测方法的一个发展方向。
技术实现思路
本技术要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、 简便、安全、快速检测BBI的免疫层析试纸。 本技术的技术方案： -种快速检测BBI的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护 层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在纤维素 膜设有用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG 抗体溶液喷点的质控线；所述结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体。 所述支撑层用不吸水的韧性材料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成；纤维素膜用硝 酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。纤维素膜 上的隐形检测线和隐形质控线为平行排列的" I I "直线式，或为其他类似印记。 快速检测BBI的胶体金免疫层析试纸的制备方法：包括用胶体金纳米颗粒标记的 BBI鼠源单克隆抗体(金标单抗)制备结合垫，用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点隐形检测线， 用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点隐形质控线，然后在支撑层上黏贴样品 垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在所述样品垫、结合垫及吸水垫上覆盖有保护膜，在样品垫 与结合垫交界处对应的保护膜上喷点有样品标记线，最后加上保护层。 该试纸利用了双抗体夹心检测抗原的原理，当试纸测试端插入待测样品溶液后， 待测溶液通过虹吸作用带动待测BBI及结合垫中的金标单抗一起向纤维素膜扩散，并最终 渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测BBI可先与金标单抗相结合，进而与纤维素 膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，金标抗体和兔源多克隆抗体分别与样品中被检测 的BBI分子上的不同抗原决定簇结合，BBI被夹在金标单抗和兔源多克隆抗体之间，形成金 标单抗-抗原-兔源多抗复合物，即双抗体夹心模式，显示红色检测印记" I ";纤维素膜上 喷点的羊或兔抗小鼠IgG抗体质控线也可与金标抗体结合，形成红色质控印记" I "，即两 条红色印记" I Γ表示为阳性；反之样品溶液中无BBI时，则不能与金标抗体结合，同样也 不能与纤维素膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，不显示红色检测印记，而纤维素膜 上喷点的羊或兔抗小鼠IgG抗体质控线可与金标抗体结合，显示红色质控线印记" I "，形 成一条红色印记" I "表示为阴性。无论结果为阳性还是阴性，都会显示红色质控印记，若 不显示则表示试纸失效。 本技术的积极有益效果： (1)特异性强，灵敏度高。本技术试纸以双抗体夹心原理为基础制备而成，两 种抗体分别为胶体金纳米颗粒标记的鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体。金标抗体中金颗 粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对 抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。试验表明，该试纸具有较高的灵敏 度，可检测100ng/mL的微量BBI ;用该试纸分别检测高浓度的glycinin、β-conglycinin、 大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子和大豆生凝集素，浓度为20mg/mL，结果检测线均不显色，说 明该试纸与这几种大豆蛋白均没有交叉反应，具有良好的特异性。 (2)简便、快速。使用本技术试纸，无需其他任何试剂和仪器，可现场操作。只 需将试纸插入被检样品液中，IOmin后即可判定检测结果。 (3)结果显示形象、直观、准确。本技术试纸以显示红色印记" I I "和" I " (或类似性状）作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示两条红色印记" I I "（检 测线和质控线)，表示被检样品中含有BBI ;显示一条红色印记" I "(质控线)，表示被检样品 中不含BBI。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和 假阴性等人为误判。 (6)节省费用。适用于进行现场检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。 (7)适用范围广，便于推广应用。本技术实现了基于双抗体夹心的原理在快速 检测BBI胶体金免疫层析试纸中的应用，该试纸操作简便，能满足不同层次人员的需要，包 括海关检疫、卫生检疫、质量监测、农畜产品生产企业和饲料加工企业等。本技术在保 障食品安全、保护对于大豆过敏的消费者健康以及保障畜禽饲料安全等方面具有极其重要 的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。【附图说明】 图1为本技术的免疫层析试纸的结构示意图。 图2为本技术的免疫层析试纸的俯视结构示意图。 图中，1为支撑层，2为样品垫，3为结合垫，4为纤维素膜，5为吸水垫，6为检测线， 7为质控线，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。【具体实施方式】 以下实施例是为了更好的解释本技术，但并不表示对本技术的特别限 定，如果没有特别说明，其中的百分含量均可理解为重量百分比。 本技术试纸的制备过程包括：BBI兔源多克隆抗体的制备、BBI鼠源单克隆抗 体的制备、结合垫的制备、样品垫的制备、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测大豆Bowman‑Brik胰蛋白酶抑制因子BBI的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，其特征在于：在纤维素膜设有用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点的隐形检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的隐形质控线；所述结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡骁飞，邢广旭，王耀，孙亚宁，柴书军，郝天红，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：新型
国别省市：河南;41
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