一种去岩藻糖基化全人源单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及针对中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的去岩藻糖基化全人源单克隆抗体、其抗原结合片段，及其应用。本发明专利技术的全人源单克隆抗体，其主要特征在于此抗体具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，包括能够裂解表达MERS-CoV S蛋白的细胞。本发明专利技术还涉及通过抑制岩藻糖基转移酶活性使得细胞表达去岩藻糖基化的MERS-CoV全人源单克隆抗体的方法。利用所述抗体可在临床上预防或治疗中东呼吸系统综合征。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及去岩藻糖基化全人源单克隆抗体，具体涉及针对中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的去岩藻糖基化全人源单克隆抗体、其抗原结合片段，及其应用。
技术介绍
现有技术公开了中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus,MERS-CoV)是一种新型冠状病毒，于2012年6月由沙特阿拉伯病毒学家AliMohZaki在一名死于急性肺炎和急性肾功能衰竭的60岁男性患者的呼吸道上皮细胞中分离出来。所述的MERS病人在临床上表现出与SARS非常相似的症状，故初期曾被称为“类SARS病毒”，其主要症状有发热、咳嗽、呼吸急促，并伴有较高比率的急性肾衰竭，致死率目前超过30％，远高于SARS流行期间约10％的致死率。调查显示，该病毒主要在中东地区流行，但目前在欧洲、北美和亚洲等地均先后出现感染病例。截至2015年7月21日，据世界卫生组织(WHO)的报道全球范围内已有1368例MERS-CoV感染的确诊病例，其中死亡人数至少有490例(http://www.who.int/csr/don/21-july-2015-mers-korea/en/)。目前MERS已波及25个国家，其中最近一波在韩国爆发的疫情发展十分迅速，自2015年5月21日以来已导致至少186人被感染(包括一名旅行至中国患者)，死亡人数已达36人，并且出现了第四代感染者。MERS爆发对全球公共卫生构成严重的威胁，到目前为止，还没有针对MERS-CoV的疫苗或特异性防治药物。所以，迫切的需要开发一种有效的抗病毒药物来对抗这一新兴的全球性威胁。研究显示了通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源、人源化及全人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际应用前景。上世纪80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界全人源单克隆抗体及新结构抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。而全人源单克隆抗体的发展，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和远大前景。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如抗甲肝病毒、汉坦病毒、RSV病毒、SARS病毒、亨尼帕病毒、埃博拉病毒等单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击；因此，研制特异性针对MERS-CoV的抗体，用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。有多个研究课题组报道了针对MERS-CoV的全人源中和抗体的发现，其中目前报道的具有最强中和活性的是从噬菌体展示的超大型Fab抗体库中筛选到的全人源单克隆抗体，m336、m337和m338，它们都被证明具有极高的病毒中和活性，对MERS-CoV假病毒的半抑制浓度(IC50)为0.05～0.017ug/ml(现有技术3)。其中m336抗体的中和活性最强，在浓度低达0.039ug/ml条件下对MERS假病毒感染的Huh-7细胞的抑制率高达90％(IC90)；同样的，m336对MERS-CoV活病毒感染VeroE6细胞诱导产生的CPE现象表现出有效抑制，其IC50为0.07ug/ml，该抗体由于具有很强的病毒中和能力，有潜力被开发为MERS防治药物用于疫情的控制。抗体依赖的细胞毒性作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)是一种经典的、由抗体Fc区域介导的用于清除感染细胞的免疫效应机理。最近有研究发现，IgG1抗体第297位天冬酰胺的糖基修饰对其免疫效应非常重要，将该位点去岩藻糖基化后，抗体会具有更强的Fcγ受体IIIa的结合能力，因此具有更强的ADCC杀伤效果(现有技术4)。比如说，一些研究证明，去岩藻糖基化的HIV-1广谱中和单克隆抗体b12与未去岩藻糖基化的b12相比，其抑制HIV-1病毒复制和通过ADCC杀伤HIV-1感染细胞的能力都增强了十倍(现有技术5)。通过往表达抗体的细胞的培养基中添加α-甘露糖苷酶抑制剂kifunensine可以生产去岩藻糖基化的抗体。因此，针对MERS-CoV的去岩藻糖基化的抗体有望具有更强的抗MERS活性。与本专利技术相关的现有技术有：1.Zaki,A.M.etal.IsolationofanovelcoronavirusfromamanwithpneumoniainSaudiArabia,NEnglJMed367,1814-1820(2012).2.Dimitrov,D.S.Therapeuticantibodies,vaccinesandantibodyomes.MAbs2,347-56(2010).3.Ying,T.etal.ExceptionallypotentneutralizationofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusbyhumanmonoclonalantibodies.JVirol88,7796-805(2014).4.Satoh,M.Non-fucosylatedtherapeuticantibodiesasnext-generationtherapeuticantibodies.ExpertOpinBiolTher6,1161-73(2006).5.Moldt,B.,etal.Anonfucosylatedvariantoftheanti-HIV-1monoclonalantibodyb12hasenhancedFcgammaRIIIa-mediatedantiviralactivityinvitrobutdoesnotimproveprotectionagainstmucosalSHIVchallengeinmacaques.JVirol86,6189-96(2012).。
技术实现思路
本专利技术目的是针对目前还没有特异性防治中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)的药物的现状，提供一种去岩藻糖基化全人源单克隆抗体及其用途，该去岩藻糖基化的全人源单克隆抗体特异性结合MERS冠状病毒表面糖蛋白；涉及的全人源单克隆抗体包括克隆m336和克隆m336-gH；本专利技术在国际上首次公开了去岩藻糖基化的MERS冠状病毒抗体具有增强的ADCC活性；本专利技术还公开了这些抗体的抗原结合片段，双特异性抗体，及与效应分子的偶联物，以及所公开的抗体和组合物可以用于，比如说，临床上预防或治疗中东呼吸系统综合征。本专利技术的全人源单克隆抗体，其主要特征在于此抗体具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，包括能够裂解表达MERS-CoVS蛋白的细胞。本专利技术还提供了通过抑制岩藻糖基转移酶活性使得细胞表达去岩藻糖基化的MERS-CoV全人源单克隆抗体的方法。在本专利技术一些实施方式中，单克隆抗体，或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列和/或重链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆m336或克隆m336-gH的轻链和/或重链可变区的互补决定区(CDR)。更具体的，本专利技术提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体，或抗原结合片段，其特征在于，包含：抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1的27‑32位，50‑52位，和/或89‑97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2的26‑33位，51‑58位，和/或97‑114位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体，或抗原结合片段，其特征在于，包含：抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及抗体的重链可变区含有SEQIDNO:2的26-33位，51-58位，和/或97-114位氨基酸。2.按权利要求1所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中：轻链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:1具有至少90％的相同性，且重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少90％的相同性。3.按权利要求1-2中任一项所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中的单克隆抗体或抗原结合片段是全人源的。4.按权利要求1-3中任一项所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的单克隆抗体为IgG。5.按权利要求1-3中任一项所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其中抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)2。6.一种双特异性抗体，其特征在于，含有权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。7.按权利要求1-5中任一项所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，或权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，与一种效应分子偶联，获得偶联物。8.按权利要求7所述的偶联物，其特征在于，其中的效应分子是可检测标记。9.权利要求8所述的偶联物，其特征在于，其中的可检测标记是荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶。10.权利要求7所述的偶联物，其特征在于，其中的效应分子是毒素或化疗剂。11.权利要求10所述的偶联物，其特征在于，其中的毒素是绿脓杆菌外毒素。12.一种核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的含有去岩藻糖基化的Fc区的单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，或权利要求7-11中任一项所述的偶联物。13.按权利要求12所述的核酸分子，可操作地连接至启动子。14.一种质粒，含有权利要求12或权利要求13所述的核酸分子。15.按权利要求14所述的质粒，其中质粒是一种病毒质粒。16.一种宿主细胞，含有权利要求14或权利要求15所述的质粒。17.一种在生物样品中检测MERS-CoV表面糖蛋白的方法，其特征在于，其包括：含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：应天雷，DS迪米特洛夫，姜世勃，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31