一种冠状病毒SARS-CoV-2锤头型核酶变体反义核酶链RNA制造技术

技术编号：41288347 阅读：7 留言：0更新日期：2024-05-11 09:37

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种冠状病毒SARS‑CoV‑2病毒的靶点序列及其潜在应用。本发明专利技术的药物靶点，其为锤头型核酶变体序列(Hammerhead Ribozyme‑like Sequences)，其序列片段选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.39。通过搜索病毒靶点序列片段的RNABOB牛物信息学策略，分析了该病毒靶点序列在SARS‑CoV‑2不同突变株中的保守和突变分析，以及该不同冠状病毒基因组中的保守和突变分析，确定了SARS‑CoV‑2基因组中具有自剪切催化活性的靶点区域，针对该区域设计对应的反义酶链RNA可实现将靶点序列催化剪切活性提高约2.8x106倍。上述靶点序列是利用反义核酶RNA催化基因组RNA自剪切，从而抑制蛋白翻译或降解基因组RNA的潜在药物和疫苗作用位点，为抗SARS‑CoV‑2病毒药物的开发提供了的理论基础和实验证据。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物，具体涉及一种冠状病毒sars-cov-2病毒的靶点序列及其潜在应用。

技术介绍

1、sars-cov-2属于β-冠状病毒，是一种正链单链rna包膜病毒，其基因组包含29903个碱基，包括两侧非翻译区(utrs)、一个5’端的长开放阅读框orf1a/b(编码nsp1-nsp16等16个非结构蛋白)、四个结构蛋白(刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n))编码区以及9个装配蛋白编码区(图1)。sars-cov-2通过s蛋白与细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)相互作用，s蛋白被切割成s1和s2两个亚基。s2亚基的融合肽结构域(fusion peptide，fp)和跨膜结构域(transmembrane，tm)分别嵌入宿主细胞膜和病毒外壳。fp和tm形成六聚物发夹结构，病毒和宿主细胞发生膜融合。随后，病毒基因组被释放到细胞质中。orf1a/b翻译得到病毒复制相关的蛋白复合体，该复合体被本瓜样蛋白酶(plpro)和3c样蛋白酶(3clpro)水解为16个nsps。在nsps作用下，新的病毒基因组rna被合成。rna复制完成后，结构蛋白也被翻译合成，和病毒基因组共同组装为成熟的病毒颗粒。最终，病毒颗粒被运送到细胞表面，通过胞吐作用释放到细胞外，进行新一轮的感染。

2、目前，新冠病毒感染的防治手段主要包括使用广谱抗病毒药物或利用分子疗法一在病毒生命周期的任一可能阶段进行干预，以抑制或阻断病毒附着和进入宿主细胞。除干扰素(i

3、许多新的联合治疗方法也表现出保护肺部免受感染的潜力。例如，包括cas13arna激活的rna酶在内的分子工具减少了肺部的病毒载量，并产生了感染病理生理学的明显变化。以此为代表的rna疗法在sars-cov-2防治中发挥着重要作用。基于rna的生物疗法具有天然的优势。由于人多数rna治疗药物依赖watson-crick碱基配对，使得它可以特异地与靶点紧密互补结合。并且，理论上无论目的基因是非编码的还是高表达的，都能够设计相应的治疗rnas去抑制目的rna，从而达到治疗多种疾病的目的。此外，rna可以通过化学方法合成，这比其他生物制剂更节约成本、更便捷。因此，rna治疗药物因其疗效高、特异性强、应用范围广而具有巨大的应用潜力。通常，rna疗法主要包括，抑制mrna翻译的反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides，aso)、rna干扰技术(rnainterference，rnai)，能够结合蛋白或其他小分子配体的适配体技术(aptamer)，具有激活能力的小型活化rna(smallactivatingrnas，sarnas)，rna疫苗，基因编辑，以及有催化活性的rna，即核酶(ribozyme)。

4、核酶能结合并剪切核苷酸磷酸二酯键，造成目标rna的特异性降解或抑制基因表达。已知的天然核酶分为：1)核糖体rna，主要参与蛋白合成过程中肽键的形成；2)分子间剪切型核酶rnasep，剪切trna前体的3’，5’-磷酸二酯键，产生5’端成熟的trna和一段有3’端羟基的前导序列；3)自剪接型核酶，包括i型内含子和ii型内含子，催化两步转酯反应释放游离的内含子并连接两侧的外显子；4)自剪切型核酶，包括hammerhead、hairpin、hepatitis delta virus(hdv)、varkud satellite(vs)、glms、twister、twister sister、pistol和hatchet等九种。和其他rna药物相比，核酶具有高特异性的基因编辑潜能和较低的免疫原性，因此被认为是治疗病毒感染疾病的有力工具。目前，在包括hcv、hiv和流感病毒在内的rna病毒中，均有基于核酶的rna治疗方法研究。然而，由于核酶作用于基因组的保守区域，而冠状病毒基因组易产生突变，使得核酶序列设计较为困难，目前少有冠状病毒感染导致的疾病的rna疗法。fukuda等研究人员开发了一种针对sars-cov的核酶疗法。该方法利用rna/dna嵌合体核酶特异性地识别病毒基因组保守区的剪切位点，结果表明rna/dna嵌合体锤头型核酶能抑制转染了重组质粒的3t3细胞中的sars-cov rna表达。sars-cov-2和sars-cov基因组相似度高约79％，因此，申请人认为核酶药物研发是治疗sars-cov-2感染的潜在方法。

技术实现思路

1、本专利技术的目的之一是提供sars-cov-2基因组中的锤头型核酶变体序列，及利用rnabob生物信息学方法搜索锤头型核酶变体序列的策略；

2、本专利技术的目的之二是提供锤头型核酶变体序列在sars-cov-2、bat-cov-ratg13、pangolin cov、sars-cov和mers-cov等冠状病毒基因组中的保守和突变对比结果，以及锤头型核酶变体序列在sars-cov-2 alpha、beta、gamma、delta和omicron突变株中的保守和突变对比结果；

3、本专利技术的目的之三是提供sars-cov-2基因组锤头型核酶变体在体外分子间催化反应中所需的温度、ph以及金属离子种类、浓度等生化条件；

4、本专利技术的目的之四是提供靶向sars-cov-2基因组锤头型核酶变体序列剪切位点的反义寡核苷酸序列。

5、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

6、本专利技术首先提供了在sars-cov-2基因组中获得锤头型核酶变体序列的rnabob生物信息学搜素策略，包含下述(1)-(3)中rnabob搜索type i、type ii和type iii型锤头型核酶变体序列的命令描述：

7、(1)rnabob descriptor

8、#type i hhrz with relax stems and loops.des

9、h1 s1 h2 s2 h2′s3 h3 s4 h3′s5 h1

10、h1 0：2**nnnn：nnnn**

11、s1 0ctganga

12、h2 0：2nnnn**：**nnnn

13、s2 0n[248]n

14、s3 0gaa

15、h3 0：0an**：**nt

16本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种可特异性与SARS-CoV-2基因不同区域结合的反义核酶链RNA，其特征在于，所述SARS-CoV-2基因不同区域包含锤头型核酶催化核心保守碱基“CUGANGA”、“GAAA”和剪切位点核苷酸三联体“NUX”，并满足锤头型核酶二级结构折叠条件的序列。

2.根据权利要求1所述的反义核酶链RNA，其特征在于，所述锤头型核酶保守催化碱基“CUGANGA”及其两侧stem I和stem II序列如SEQ ID No.40～SEQ ID No.56所示。

3.根据权利要求1所述的反义核酶链RNA，其特征在于，所述SARS-CoV-2基因不同区域为SEQ ID NO：1-39中所示的一种或多种组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义核酶链RNA，其特征在于，所述反义核酶链RNA序列为如下一种或多种的组合：针对SEQ ID No.2靶点剪切位点序列设计的反义核酶链RNA序列为SEQ ID No.68～SEQ ID No.69；针对SEQ ID No.4靶点剪切位点序列设计的反义核酶链RNA序列为SEQ ID No.71～SEQ ID No.7

5.一种用于转录如权利要求4所述反义核酶链RNA的引物组合，其特征在于，靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.68的引物为SEQ ID No.79～SEQ ID No.80；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.69的引物为SEQ ID No.81～SEQ ID No.82；靶点反义核酶链RNA序列SEQID No.71的引物为SEQ ID No.83～SEQ ID No.84；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.72的引物为SEQ ID No.85～SEQ ID No.86；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.74的引物为SEQ ID No.87～SEQ ID No.88；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.75的引物为SEQ IDNo.89～SEQ ID No.90；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.77的引物为SEQ ID No.91～SEQ ID No.92；靶点反义核酶链RNA序列SEQ ID No.78的引物为SEQ ID No.93～SEQ IDNo.94。

6.一种用于转录SARS-CoV-2基因不同区域的引物组合物，其特征在于，针对SEQ IDNo.9的引物为SEQ ID No.57～SEQ ID No.58；针对SEQ ID No.29的引物为SEQ ID No.59～SEQ ID No.60；针对SEQ ID No.2的引物为SEQ ID No.61～SEQ ID No.62；针对SEQ IDNo.4的引物为SEQ ID No.63～SEQ ID No.64，针对经典锤头型核酶HH16酶链RNA序列的引物为SEQ ID No.65～SEQ ID No.66。

7.一种包含如权利要求1-6中任一项所述的反义核酶链RNA和/或引物组合的试剂盒。

8.如权利要求1-7中任一项所述的反义核酶链RNA、引物组合和/或试剂盒在制备治疗SARS-CoV-2所致疾病的药物中的应用。

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【技术特征摘要】

1.一种可特异性与sars-cov-2基因不同区域结合的反义核酶链rna，其特征在于，所述sars-cov-2基因不同区域包含锤头型核酶催化核心保守碱基“cuganga”、“gaaa”和剪切位点核苷酸三联体“nux”，并满足锤头型核酶二级结构折叠条件的序列。

2.根据权利要求1所述的反义核酶链rna，其特征在于，所述锤头型核酶保守催化碱基“cuganga”及其两侧stem i和stem ii序列如seq id no.40～seq id no.56所示。

3.根据权利要求1所述的反义核酶链rna，其特征在于，所述sars-cov-2基因不同区域为seq id no：1-39中所示的一种或多种组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义核酶链rna，其特征在于，所述反义核酶链rna序列为如下一种或多种的组合：针对seq id no.2靶点剪切位点序列设计的反义核酶链rna序列为seq id no.68～seq id no.69；针对seq id no.4靶点剪切位点序列设计的反义核酶链rna序列为seq id no.71～seq id no.72；针对seq id no.9靶点剪切位点序列设计的反义核酶链rna序列为seq id no.74～seq id no.75；针对seq id no.29靶点剪切位点序列设计的反义核酶链rna序列为seq id no.77～seq id no.78。

5.一种用于转录如权利要求4所述反义核酶链rna的引物组合，其特征在于，靶点反义核酶链rna序列seq id no.68的引物为seq id no.79～seq id no.80；靶点反义核酶链rna序列seq id n...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘格彤，陈东戎，阿拉斯泰尔·莫奇，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：

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