筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用技术

筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用,本发明专利技术提供了构建表达抗体和IgG‑Fc融合蛋白岩藻糖缺陷型的宿主细胞方法及抗体和IgG‑Fc融合蛋白岩藻糖活性的检测方法，及此类细胞株的具体应用。本发明专利技术通过TALEN(和/或CRISPR)技术高效敲除生产抗体或IgG‑Fc融合蛋白工程细胞中的岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的表达来实现，通过小扁豆凝集素(LCA)加压、基因测序、流式细胞仪筛选方法，获得岩藻糖高效敲除的宿主细胞。并将岩藻糖缺陷的CHOK1宿主细胞株构建成表达抗体蛋白的稳定工程细胞株，获得抗体蛋白后进行糖型分析，结果表明岩藻糖敲除效率达99％以上。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及利用现有的TALEN和/或CRISPR/CAS9技术，使CHO细胞的FUT8基因发生缺失或突变，进而使其产生岩藻糖的通路受阻，用此细胞株表达的抗体或IgG-Fc融合蛋白岩藻糖含量明显减少，且ADCC活性功能显著提高。技术背景本专利技术所用TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB，Double-Strand Breaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ,Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。在生物医药领域,已经有很多研究将此技术应用到宿主细胞的改造，来提高宿主细胞生产蛋白的质量和活性。本专利技术在其某些实施方式中涉及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，产生该细胞系的方法及其应用。重组的治疗性抗体或IgG-Fc融合蛋白在治疗各种各样疾病中已发挥了重要作用。估计下一个十年中可能约30％新出现的药物基于抗体。已批准了30种重组抗体和Fc融合物进入市场，2008年销售额达到350亿美元。抗体含有由重链和轻链可变区组成的靶抗原特异性区域。抗体的这个部分可结合和中和可溶性靶抗原或膜结合的靶抗原。Fc部分通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)机制、补体依赖的复合体和新生受体FcRn机制负责效应器功能。通过效应分子与铰链区和Fc的CH2区的相互作用介导了这些效应器功能。CH2区含有一个位于抗体297位N糖基化位点的寡糖，已知其在结合效应细胞中起着重要作 用。该寡糖通常由具有相当大异质性的双触角型复合体如核心戊糖与附加的可变外糖残基一起组成。ADCC是一种重要的抗体结合靶细胞膜配体的杀伤机制。白细胞上表达的FcyR能结合抗体的CH2区。一旦结合，与靶细胞上的抗原产生免疫复合体而启动白细胞活化。这种活化可包括吞噬和细胞介质的释放，这些介质导致细胞通透增加和死亡。ADCC活性一方面依赖于IgG同种型，另一方面依赖于特异性的FcyR。IgGl和IgG3可诱导这种活性，而IgG4则不能。能结合IgG并对ADCC激活机制重要的FcYR称为FcYRIIIa，其表达在NK细胞和巨噬细胞上。在许多情况下通过NK细胞与靶细胞的结合所获得的ADCC活性并不足以实施对靶细胞的杀伤。其原因是FcYRIIIa对IgGl的亲和力低。与表达FcYRIIIa-158Phe的患者相比，见于10-15％人群的表达高亲和力同种异型FcYRIIIa-158Val的患者中，发现ADCC活性增强。也可通过对IgG-Fc操作来获得ADCC增强。利用计算机设计算法对抗体进行工程改造，并用高通量筛选来选择高亲和力抗体。这一工作产生了在体外显示效应器功能增强大于2个数量级的抗体(Lazar，Dang等；2006)，虽然测得突变的IgGl(含S239D、A330L和I332E的IgGl)热稳定性降低。获得ADCC增强的抗体的另一种方法是产生寡糖上297位的岩藻糖水平低的抗体。先前曾发现该寡糖上的岩藻糖残基可干扰Fc与FcYRIIIa的结合(Shinkawa，Nakamura等；2003)。获得低岩藻糖水平抗体的一种方法是采用具有这种天然能力的控制细胞，如大鼠杂交瘤YB2/0细胞(Shinkawa，Nakamura等；2003)，然而这些细胞产生的重组蛋白的岩藻糖含量水平是可变的。几种可能采用的其他非哺乳动物细胞包括Vivalis类的禽细胞，Biolex公司工程改造的水生植物浮萍(Cox,Sterling等；2006)和Igeneon公司的变种Physocmirtella苔藓(Nechansky，Schuster等；2007)。此外，GlycoFi制备了具有几种糖基化能力包括增强ADCC的多种毕赤酵母细胞系(Hamilton，Davidson等；2006)。也可采用几种哺乳动物细胞来制备具有各种通用糖基化能力特别是增强ADCC的抗体。Glycotope创造了多种糖基经工程改造的人细胞系以产生糖基优化的生物治疗剂。罗氏公司通过导入一种能催化形成涉及抗体依赖性细胞毒(ADCC)的二等份寡糖的糖基转移酶，0(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IlKGnTIII)，获得了Glycart，一种能产生岩藻糖水平降低的重组抗体的基因工程细胞系，(Umana，Jean-Mairet等；1999)。Biowa公司制备了岩藻糖转移酶基因(Fut8)被敲除的CHO DG44细胞以降低岩藻糖水平 (Yamane-Ohnuki,Kinoshita等；2004)。近年研究证明在胞质内异源表达的原核酶，(3)P-6-脱氧-D-来苏糖-4-已酮糖还原酶，能阻断中间体GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖转变成终末产物，这在脊椎动物细胞中通常不会发生。因此，用这种方法修饰的CHO细胞分泌的抗体缺乏核心岩藻糖(von Horsten，Ogorek等)。另一种方法是制备能在毒性岩藻糖特异性凝集素存在下存活的凝集素抗性突变体。Lecl3细胞是基于在毒碗豆岩藻糖特异性凝集素存在下培育CHO细胞所产生的一种CHO细胞系(Ripka和Stanley,1986)。Lecl3细胞缺乏(3)P-甘露糖4，6-脱水酶活性，导致表达的人IgGl缺乏岩藻糖(Shields，Lai等；2002)。美国专利申请No.2010/0081150报告了用化学方法处理和选择显示变体糖基化模式的细胞(包括用高剂量岩藻糖杀伤细胞以降低岩藻糖基化)所产生的CHO细胞突变体，以产生用于表达抗体的细胞。美国专利申请No.2010/0304436报告了通过突变Fx蛋白和调控外源岩藻糖的利用度产生岩藻糖基化降低的CHO细胞系，以指导细胞岩藻糖基化多肽的能力。Kanda等(Kanda,Imai-Nishiya等，2007)公开了GMD和FUT8基因被敲除的宿主细胞系。该GMD敲除细胞具有与GMD外显子5，6和7区相应的基因组缺失。Ripka等(Ripka和Stanley，1986)公开了4种凝集素抗性CHO突变细胞。通过用N-甲基-N-亚硝基胍培育产生这类突变。Shields等(Shields,Lai等；2002)公开了Lecl3(岩藻糖缺陷的CHO)细胞系产生的IgGl提高了与FcYRIIIa的结合高达50倍，其ADCC也增强。Kanda等(Kanda,Yamane-Ohnuki等，2006)公开了Lecl3细胞可产生50-70％岩藻糖基化的抗体，然而该已知的细胞系不能稳定产生抗体。因此Lecl3细胞系不适合作为生产细胞系。在如Yamane-Ohnuki 2004和Kyowa Hakko专利所述的FUT8敲除细胞系中，抗体的产本文档来自技高网...

【技术保护点】
在哺乳动物宿主细胞中产生包含低抗体或IgG‑Fc融合蛋白岩藻糖含量抗体的方法，包括将至少一种编码靶向FUT8基因序列SEQ ID NO.1和FUT8基因Exon1区域的不同编码区的至少一种TALEN(和/或CRISPR/CAS9)的载体同时引入宿主细胞，抑制fut8的表达并降低抗体或IgG‑Fc融合蛋白的岩藻糖化水平，通过LCA方法分选获得岩藻糖缺陷型的稳定宿主细胞株。

【技术特征摘要】
1.在哺乳动物宿主细胞中产生包含低抗体或IgG-Fc融合蛋白岩藻糖含量抗体的方法，包括将至少一种编码靶向FUT8基因序列SEQ ID NO.1和FUT8基因Exon1区域的不同编码区的至少一种TALEN(和/或CRISPR/CAS9)的载体同时引入宿主细胞，抑制fut8的表达并降低抗体或IgG-Fc融合蛋白的岩藻糖化水平，通过LCA方法分选获得岩藻糖缺陷型的稳定宿主细胞株。2.权利要求1的方法，其中靶向FUT8基因的TALEN编码TALEN-1和2序列的TALEN-L、TALEN-R和Spacer序列分别选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22进行序列分析所使用的PCR引物选自SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱晓东，张海涛，
申请(专利权)人：北京康明生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11