核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，选择最有效RNA干涉靶序列，在体外合成两段互补的寡核苷酸，利用载体上的BamH?Ⅰ和Cla?Ⅰ酶切位点，将Fut8基因siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi-hU6中。经293T细胞包装后，重组逆转录病毒滴度可达2.1×105CFU/ml，产生的重组逆转录病毒感染前B细胞株通过400-1000ug/ml?G418筛选获得稳定表达株。用Real?time-PCR及高效液相色谱（HPLC）检测结果表明，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒感染70Z/3细胞中，Fut8mRNA及酶活性显著下降。本发明专利技术具有操作简单，基因沉默效率高、重复性好等优点。Fut8基因沉默细胞模型的建立为Fut8基因生物学功能研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物学功能研究领域，更具体地说，涉及一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型建立方法。
技术介绍
核心岩藻糖基化是普遍的蛋白质翻译后修饰过程。FutS是修饰核心岩藻糖基化的唯一的糖基转移酶(如图8所示)，能够调节蛋白质的空间结构和生物学功能，如分子间相互作用、细胞与细胞间的相互识别、蛋白质的正确定位、细胞信号传导等。FutS+小鼠有肺气肿表现型，这是因为转化生长因子I受体上的核心岩藻糖基缺损则降低TGF I与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶(MMP)的表达，引起肺气肿病变；Fut8基因敲除导致细胞表面的血管内皮生长因子受体表达量下降。另外，Stubbs等发现核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的N-糖链的分子构象和柔软性。目前常用的方法是利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)或基因敲除方法，抑制该基因表达，观察相应功能的丢失。基因敲除方法既费时间又需要尖端实验设备。RNA i发现为人们提供了特异性阻断基因表达的新策略。RNA i通过在细胞内转染与靶基因相同序列的2Ibp的双链RNA，即可使靶基因降解，而且具有特异性强、抑制效率高等特点。目前本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据Fut8基因序列，设计1条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列：CUGAUCACU?CCAGCAGAGA（759?778）；并设计Fut8siRNA双链短发夹结构：siRNA?sense:5′?GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT?3′;siRNA?antisense:5′?CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG?3′S2、将该条Fut8siR...

【技术特征摘要】
1.一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤 51、根据Fut8基因序列，设计I条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)； 并设计Fut8siRNA双链短发夹结构 siRNA-sense:5' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3' 52、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi_hU6中，构建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 载体； 53、Fut8基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步 531、用脂质体转染法将PSINs1-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho载体，pGP载体共同转染293T细胞，包装携带有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆转录病毒； 532、将3-5X IO4靶细胞进行9-12h培养，利用7-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文哲，金锦花，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：