本发明专利技术公开了一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，选择最有效RNA干涉靶序列，在体外合成两段互补的寡核苷酸，利用载体上的BamH?Ⅰ和Cla?Ⅰ酶切位点，将Fut8基因siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi-hU6中。经293T细胞包装后，重组逆转录病毒滴度可达2.1×105CFU/ml，产生的重组逆转录病毒感染前B细胞株通过400-1000ug/ml?G418筛选获得稳定表达株。用Real?time-PCR及高效液相色谱（HPLC）检测结果表明，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒感染70Z/3细胞中，Fut8mRNA及酶活性显著下降。本发明专利技术具有操作简单，基因沉默效率高、重复性好等优点。Fut8基因沉默细胞模型的建立为Fut8基因生物学功能研究奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物学功能研究领域，更具体地说，涉及一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型建立方法。
技术介绍
核心岩藻糖基化是普遍的蛋白质翻译后修饰过程。FutS是修饰核心岩藻糖基化的唯一的糖基转移酶(如图8所示)，能够调节蛋白质的空间结构和生物学功能，如分子间相互作用、细胞与细胞间的相互识别、蛋白质的正确定位、细胞信号传导等。FutS+小鼠有肺气肿表现型，这是因为转化生长因子I受体上的核心岩藻糖基缺损则降低TGF I与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶(MMP)的表达，引起肺气肿病变；Fut8基因敲除导致细胞表面的血管内皮生长因子受体表达量下降。另外，Stubbs等发现核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的N-糖链的分子构象和柔软性。目前常用的方法是利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)或基因敲除方法，抑制该基因表达，观察相应功能的丢失。基因敲除方法既费时间又需要尖端实验设备。RNA i发现为人们提供了特异性阻断基因表达的新策略。RNA i通过在细胞内转染与靶基因相同序列的2Ibp的双链RNA，即可使靶基因降解，而且具有特异性强、抑制效率高等特点。目前常用的siRNA导入方法是利用脂质体导入双链siRNA或含有siRNA序列的载体，但是上述方法存在siRNA进入细胞后容易被降解、在细胞内的效应持续时间短、siRNA表达载体转染效率低等问题。针对这种情况，目前应用较多的是逆转录病毒、腺病毒、脂质体等载体。目前，有关一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型建立方法的文章及专利如下(I)用于失活a -1，6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因表达的方法和组合物(专利公开号CN101883850A) (2) Methods and compositions for inactivating alphaI, 6fucosy I transferase (FUT8) gene expression (专利公开号=US2OO9(M225C) (Al))(3) Compositon for suppressing the expression of fucosyltransferase (专利公开号US2009221065(A1))(4) Wang X, Inoue S, Gu J, et al. Dysregulation of TGF-betalreceptoractivation leads to abnormal lung development and emphysema-1 ike phenotype incore fucose-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102 (44):15791-6.(5)Stubbs HJ et al.1nfluence of core fucosylation on the flexibility ofa biantennary N-1inked oligosaccharide. Biochemistry 1996, 35:937-947.专利1-3专利技术使用包含锌指蛋白和切割结构域或切割半结构域的融合蛋白来失活FUT8基因的方法和组合物。还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白的细胞。文章4介绍转化生长因子I受体上的核心岩藻糖基缺损则降低TGFl与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶(MMP)的表达，引起肺气肿病变。文章5介绍核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的N-糖链的分子构象和柔软性。目前，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒构建Fut8基因沉默细胞模型的研究尚无报道。
技术实现思路
本专利技术利用重组逆转录病毒载体构建了 PSINs1-hU6-Fut8siRNA载体，克服了传统载体的诸多弊端，以稳定表达Fut8siRNA，通过细胞感染的方式快速建立Fut8基因沉默细胞模型，旨在为Fut8基因生物学功能研究奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，包括如下步骤Stepl、根据Fut8基因序列，设计I条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)；并设计Fut8siRNA双链短发夹结构siRNA-sense:5 ' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3'Step 2、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi_hU6中，构建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 载体；Step 3、FutS基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步Step 31、用脂质体转染法将 pSINs1-hU6_Fut8siRNA, pE-ampho 载体，pGP 载体共同转染293T细胞，包装携带有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆转录病毒；Step 32、将 3-5X IO4祀细胞进行 9_12h 培养,利用 7-lOug/mL polybrane 孵育后，通过病毒感染方式将Fut8siRNA转染至靶细胞内；Step 33、用400-1000ug/ml G418进行筛选，并挑取单个细胞，进行扩大培养，获得稳定的Fut8基因沉默细胞模型。优选方式下，Step31 中的的脂质体与 pSINs1-hU6_Fut8siRNA、pE-ampho 载体、PGP载体的摩尔浓度比例为4-5 :1. 5-2 1-1. 5 1-1. 5 ；Step 32中病毒液与细胞培养液之间的比例为1-2:10。本专利技术还提供了上述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的检测方法，选用实时定量PCR鉴定，其中，所述实时定量PCR的引物序列为sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG, antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。本专利技术还提供了上述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型酶活性的检测方法，利用HPLC法测定Fut8酶活性，细胞裂解液蛋白含量为0. 2-0. 5mg,反应时间为2_5小时。本专利技术在4种优先设计的FutS基因RNA干涉靶序列中选择最有效RNA干涉靶序列。根据该序列在体外合成两段互补的寡核苷酸，利用载体上的BamH I和Cla I酶切位点，将Fut8基因siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINs1-hU6中。经293T细胞包装后，重组逆转录病毒滴度可达2. lX105CFU/ml,产生的重组逆转录病毒感染前B细胞株(70Z/3细胞)，通过400-1000ug/ml G418筛选获得稳定表达株，命名为Fut8-KD-70Z/3。用Realtime-PCR及高效液相色谱(HPLC)检测结果表明，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒感染70Z/3细胞中，FutSmRNA及酶活性显著下降。该专利技术具有操作简单，基因沉默效率高、重复性好等优点。Fut8基因沉默细胞模型的建立为Fut8基因生物学功能研本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据Fut8基因序列，设计1条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列：CUGAUCACU?CCAGCAGAGA（759?778）；并设计Fut8siRNA双链短发夹结构：siRNA?sense:5′?GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT?3′;siRNA?antisense:5′?CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG?3′S2、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi?hU6中，构建pSINsi?hU6?Fut8siRNA载体；S3、Fut8基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步：S31、用脂质体转染法将pSINsi?hU6?Fut8siRNA，pE?ampho载体，pGP载体共同转染293T细胞，包装携带有pSINsi?hU6?Fut8siRNA的逆转录病毒；S32、将3?5×104靶细胞进行9?12h培养，利用7?10ug/mL?polybrane孵育后，通过病毒感染方式将Fut8siRNA转染至靶细胞内；S33、用400?1000ug/ml?G418进行筛选，并挑取单个细胞，进行扩大培养，获得稳定的Fut8基因沉默细胞模型。...
【技术特征摘要】
1.一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤 51、根据Fut8基因序列，设计I条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)； 并设计Fut8siRNA双链短发夹结构 siRNA-sense:5' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3' 52、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi_hU6中，构建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 载体； 53、Fut8基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步 531、用脂质体转染法将PSINs1-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho载体，pGP载体共同转染293T细胞，包装携带有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆转录病毒； 532、将3-5X IO4靶细胞进行9-12h培养，利用7-...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文哲，金锦花，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：
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