抗体体内半寿期的体外预测制造技术

本文中报道了一种用于确定抗体‑Fc‑FcRn复合物中存在影响体内半寿期的抗体‑Fab‑FcRn相互作用的方法，所述方法包括步骤a)在第一氯化钠浓度存在下确定抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，和b)在第二氯化钠浓度存在下确定抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，因而如果步骤a)中确定的保留时间和步骤b)中确定的保留时间实质上不同，则确定抗体‑Fc‑FcRn复合物中存在影响体内半寿期的抗体‑Fab‑FcRn相互作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术属于重组抗体
，特别地属于定制抗体领域。本文中报道了一种基于FcRn亲和层析柱上确定的保留时间预测抗体体内半寿期的方法。专利技术背景G类人免疫球蛋白(IgG)含有两个赋予靶抗原特异性的抗原结合(Fab)区和一个负责与Fc受体相互作用的恒定区(Fc区)([1,2])。人IgG亚类1、2和4具有21天的平均血清半寿期，其长于任何其他已知血清蛋白的平均血清半寿期([3])。这种长半寿期主要由Fc区和新生Fc受体(FcRn)之间的相互作用介导([4,5])。这是为何使用IgG或含有Fc的融合蛋白作为一类广泛治疗药的原因之一。新生Fc受体FcRn是涉及IgG和白蛋白稳态、母源IgG跨胎盘转运及抗原-IgG免疫复合物吞噬的膜结合受体([6,9])。人FcRn是由糖基化I类主要组织相容性复合体样蛋白(α-FcRn)和β2微球蛋白(β2m)亚基组成的异二聚体([10])。FcRn与Fc区的CH2-CH3区域中的位点结合([11-14])并且两个FcRn分子可以同时与Fc区结合([15,16])。FcRn和Fc区之间的亲和力是pH依赖的，在内体pH 5-6显示纳摩尔亲和力及在生理pH 7.4显示可忽略不计的结合作用([13,17,18])。赋予IgG长半寿期的基础机制可以由三个基本步骤解释。首先，IgG受到多种细胞类型的非特异性胞饮作用([19,20])。其次，IgG在酸性内体中在pH 5-6遇到并结合FcRn，因而保护IgG免遭溶酶体降解([11,21])。最后，IgG在胞外间隙中在生理pH 7.4释放[4]。这种严格的pH依赖性结合和释放机制对IgG再生至关重要并且在不同pH值的结合特征的任何偏差可能强烈地影响IgG的循环半寿期([22])。除Fc区与FcRn特异性相互作用之外，还已经提出Fab区有助于FcRn结合([23-25])。例如，在中性pH时Fab介导的残余结合作用与一组治疗性抗体的药代动力学特性相关，这表明在pH 7.3与FcRn过多结合的IgG遭遇终末半寿期减少([24])。最近，Schlothauer等人([25])已经描述了一种新的pH梯度FcRn亲和层析方法，所述方法密切模拟FcRn和IgG之间解离的生理状况。另外，他们显示，具有相同Fc区的IgG在其从FcRn解离方面有差异，因而提示Fab区影响FcRn结合作用。但是，Fab区如何影响FcRn结合作用的基础机制仍未阐明。Schlothauer,T.等人报道了用于功能性表征单克隆抗体的分析性FcRn亲和层析([25])。Wang,W.等人([24])报道，具有相同Fc序列的单克隆抗体可以与FcRn差异性结合，连同药代动力学结果。Suzuki,T.等人报道了新生FcR在调节含有人IgG1Fc结构域的治疗性蛋白的血清半寿期中的重要性([23])。Igawa,T.等人([37])报道了通过工程化可变区减少IgG抗体的消除。Vaccaro,C.等人报道了工程化免疫球蛋白G的Fc区以调节体内抗体水平([22])。Prabhat,P.等人([40])报告通过使用多焦平面显微术，阐明导致胞吐Fc受体(FcRn)的胞内再生途径。Putnam,W.S.等人报道了单克隆抗体的药代动力学、药效动力学和免疫原性可比性评估策略([36])。Boswell,C.A.等人([38])报道了电荷对抗体组织分布和药代动力学的影响。Khawli,L.A.等人报道了用生物素化学修饰后放射碘化的嵌合TNT-1、-2和-3单克隆抗体的药代动力学特征和生物分布([35])。在WO 2013/120929中报道了基于Fc受体的亲和层析。在US 2011/0111406中报道了一种将抗原结合分子与抗原多次结合的方法。在US 2014/0013456中报道了组氨酸工程化的轻链抗体和用于产生相同轻链抗体的基因修饰的非人类动物。最近已经讨论了Fab区对FcRn相互作用的影响([23,24,25])。然而，具有相同Fc区的抗体并不简单地必然具有相似的PK特征。已经报道Fab区对FcRn结合作用的额外贡献，但是基础机制仍未知([47],[24],[25])。除Fc区与FcRn的特异性相互作用之外，还提出Fab区有助于FcRn-IgG相互作用([37,24,25])。推迟发表的Li，B.等人([48])报道，框架选择可以通过分子电荷的差异影响人源化治疗性抗体的药代动力学。Sampei,Z.等人([49])报告模拟因子VIII辅因子活性的功能的非对称双特异性IgG抗体的鉴定和多维优化。Wang等人([24])报道，具有不同靶特异性和Fab区但Fc序列相同的IgG可以具有不同的FcRn亲和力。在近乎生理pH时Fab介导的残余结合作用与一组治疗性抗体的药代动力学特性相关，这表明在pH 7.3与FcRn过多结合的IgG遭遇终末半寿期减少。最近，Schlothauer等人([25])已经描述了一种新的pH梯度FcRn亲和层析方法，所述方法密切模拟FcRn和IgG之间解离的生理状况。另外，他们显示，具有相同Fc区的IgG在体外从FcRn解离方面有差异，因而提示Fab区影响FcRn-IgG结合作用。Benson,J.M.等人([50])报道了优特克单抗(Ustekinumab)(用于治疗免疫介导疾病的靶向白介素-12和白介素-23的人单克隆抗体)的发现和机制。WO 2013/087911中报道了抗体布雷奴单抗(Briakinumab)的氨基酸序列(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40)，WO 2013/087911中报道了抗体优特克单抗的氨基酸序列(SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38)并且药物库条目DB00112中报道了抗体贝伐单抗的氨基酸序列。专利技术简述已经发现，Fv结构域中的电荷分布影响抗体-FcRn结合并导致抗体和FcRn之间的额外相互作用。这改变了FcRn结合作用特征，尤其相对于抗体-FcRn复合物在pH 7.4的解离而言，因而减少抗体的FcRn依赖性终末半寿期。如本文中报道的一个方面是一种用于确定存在影响抗体体内半寿期的抗体-Fab-FcRn相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：a)在第一盐浓度存在下确定抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，b)在第二盐浓度存在下确定抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，因而如果步骤a)中确定的保留时间和步骤b)中确定的保留时间实质上不同，则确定存在影响抗体体内半寿期的抗体-Fab-FcRn相互作用。抗体-Fab-FcRn相互作用是抗体的Fab-区域与FcRn之间的相互作用。如果确实存在，在抗体已经由FcRn结合后，这种相互作用出现。因此，这种相互作用的建立是两步骤过程。在第一步骤中，形成抗体-FcRn复合物，更精确地，抗体-Fc-FcRn复合物。在抗体-Fc-FcRn复合物已经形成后的第二步骤是抗体-Fab-FcRn相互作用的建立。如可以从这里见到，仅采用全长抗体时，才可以建立这两种相互作用，即抗体-Fc-FcRn相互作用和抗体-Fab-FcRn相互作用。如本文中报道的一个方面是一种用于确定抗体-FcRn复合物中存在影响体内半寿期的Fab-FcRn相互作用的方法，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于选择抗体的方法，包括以下步骤i)在第一盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第一保留时间，并且在第二盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第二保留时间，或ii)在第一pH值确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第一保留时间，并且在第二pH值确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第二保留时间，或iii)使用表面等离子体共振法确定抗体和参考抗体在pH 6的KD值，并且在高盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或iv)使用表面等离子体共振法确定抗体和参考抗体在pH 6的KD值，并且确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或v)确定抗体及其Fc区在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或vi)在高pH值确定抗体及其Fc区在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或vii)使用表面等离子体共振法确定抗体及其Fc区在pH 6的KD值，并且在高盐浓度存在下确定抗体及其Fc区在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或viii)使用表面等离子体共振法确定抗体及其Fc区在pH 6的KD值，并且在高pH值确定抗体及其Fc区在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，和通过选择a)抗体，所述抗体具有与第二保留时间基本上相同的第一保留时间，或b)抗体，所述抗体具有与参考抗体的KD值不同最多10倍的KD值并且具有与参考抗体的保留时间基本上相同的保留时间，或c)抗体，所述抗体具有与其Fc区的保留时间基本上相同的保留时间，或d)抗体，所述抗体具有与其Fc区的KD值不同最多10倍的KD值并且具有与其Fc区的保留时间基本上相同的保留时间。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.21 EP 14161103.8;2014.04.25 EP 14165987.01.一种用于选择抗体的方法，包括以下步骤i)在第一盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第一保留时间，并且在第二盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第二保留时间，或ii)在第一pH值确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第一保留时间，并且在第二pH值确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的第二保留时间，或iii)使用表面等离子体共振法确定抗体和参考抗体在pH 6的KD值，并且在高盐浓度存在下确定抗体和参考抗体在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或iv)使用表面等离子体共振法确定抗体和参考抗体在pH 6的KD值，并且确定抗体和参考抗体在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或v)确定抗体及其Fc区在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或vi)在高pH值确定抗体及其Fc区在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或vii)使用表面等离子体共振法确定抗体及其Fc区在pH 6的KD值，并且在高盐浓度存在下确定抗体及其Fc区在采用正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，或viii)使用表面等离子体共振法确定抗体及其Fc区在pH 6的KD值，并且在高pH值确定抗体及其Fc区在采用线性盐梯度洗脱的FcRn亲和层析柱上的保留时间，和通过选择a)抗体，所述抗体具有与第二保留时间基本上相同的第一保留时间，或b)抗体，所述抗体具有与参考抗体的KD值不同最多10倍的KD值并且具有与参考抗体的保留时间基本上相同的保留时间，或c)抗体，所述抗体具有与其Fc区的保留时间基本上相同的保留时间，或d)抗体，所述抗体具有与其Fc区的KD值不同最多10倍的KD值并且具有与其Fc区的保留时间基本上相同的保留时间。2.根据权利要求1所述的方法，其中方法用于选择这样的抗体，所述抗体不含影响抗体体内半寿期的抗体-Fab-FcRn相互作用。3.根据权利要求1所述的方法，其中-方法用于选择这样的抗体，所述抗体具有与IgG1、IgG3或IgG4亚类的抗体相比增加的相对体内半寿期，并且-在v)、vi)、vii)和viii)中，进一步确定参考抗体或参考Fc区的保留时间，并且-通过选择a)抗体，所述抗体具有比参考抗体的第一保留时间长的第一保留时间和与第二保留时间基本上相同的第一保留时间，或b)抗体，所述抗体具有与参考抗体的KD值不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·埃姆里希，H·克腾伯格，T·施洛特豪尔，A·肖赫，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH